이 프로토콜은 신경 활동에 대한 정확한 공간적 시간 정보를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 공간적 시간 해상도로 신경 활동을 조작하고 평가할 수 있다는 것입니다. 신경 활동의 이상을 유발하는 신경 정신 장애의 병원체를 설명하는 데 유용 할 수 있습니다.
이 방법은 뉴런 연구뿐만 아니라 다른 장기의 건강에도 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 대학원생 Zhongtian Guo가 될 것입니다. 두판 이식 1일 후, 뇌부종을 피하기 위해 수술 1시간 전에 덱사메타손 인산나트륨을 킬로그램당 1.32mg을 복강 투여합니다.
입체경 아래에서 치과 용 드릴을 사용하여 직경 약 2mm의 원형 개두술을 시행하십시오. 뇌 손상을 줄이려면 치과용 드릴을 일정한 약간의 움직임과 가벼운 하향 압력으로 조심스럽게 작동하십시오. 흡입 시스템을 사용하여 뼈 조각을 여러 번 제거하십시오.
뼈 조각을 제거한 후 인공 척수액 또는 ACSF 용액을 사용하여 뇌 표면에 남아 있는 파편을 제거하고 씻어냅니다. 염증 반응을 억제하기 위해이 세척 절차를 여러 번 반복하십시오. 압력 주입 시스템을 사용하여 팁 직경이 10-20 마이크로 미터 인 유리 모세관을 통해 500 나노 리터의 AAV 용액을 10 분 동안 주입하도록 적절한 압력을 설정하십시오.
유리 모세관에서 AAV 용액의 수준이 점차 감소하면 AAV 용액이 뇌에 투여되고 있습니다. 역류를 방지하기 위해 유리 모세관을 추가로 10분 동안 제자리에 두십시오. 이것을 세 번 반복하여 총 1.5 마이크로 리터의 AAV 용액을 뇌에 투여합니다.
마이크로피펫을 사용하여 S1의 뇌 표면에 2%의 저융점 아가로스를 적용한 다음 두 개의 커버 안경으로 개두술 위에 유리창을 놓습니다. 덮개 유리가 아직 액체 상태일 때 아가로스에 대해 누르십시오. 이것은 아가로스에 기포가 형성되는 것을 방지합니다.
두개골 창의 가장자리를 치과용 접착 수지 시멘트로 밀봉합니다. 홀로그램 자극 시스템을 보정하려면 빨간색 형광 슬라이드의 표면을 샘플 평면에 놓고 약한 여기광으로 현미경을 라이브 이미징 모드로 설정합니다. 보정 GUI를 실행합니다.
mfile에서 매개 변수 창을 확인하고 저장 버튼을 클릭합니다. 1단계 창에서 Z 스캔 버튼을 클릭하면 각 평면에서 2마이크로미터 떨어진 21개의 서로 다른 축 평면에 3개의 무작위 스폿이 자동으로 생성됩니다. 슬라이드 바를 움직여 라이브 이미지를 확인합니다.
스폿이 가장 작고 밝게 나타나는 완벽한 평면을 찾은 다음 저장 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 디지털 홀로그램에 대한 오프셋 구형 파면이 자동으로 생성됩니다. 2단계 창에서 이동 단추를 클릭한 다음 왼쪽 사각형에 있는 6개의 지점을 클릭합니다.
라이브 이미지를 확인합니다. 구별 가능한 형광 반점이 6개 있는 경우 해당 x축과 Y축을 편집 상자에 입력하고 저장 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 홀로그램 자극과 이미징 시스템 간의 보정을 조정하기 위해 미세 변환 계수가 자동으로 생성됩니다.
그런 다음 스캔 3단계 창에서 버튼을 클릭합니다. 441개의 디지털 홀로그램을 생성하여 21 x 21 단계로 시야 전체에서 단일 스팟 스캔을 수행합니다. 목록 상자에서 패턴을 변경하는 동안 이미지를 확인하십시오.
레이저 출력을 조정하여 이미징 장치의 다이내믹 레인지 내에서 스폿 이미지를 얻습니다. 이미징 장치를 녹화 모드로 전환하고 재생 버튼을 클릭합니다. 플레이가 완료되면 4단계 창에서 가중치 맵 생성을 클릭하고 누적된 이미지를 선택합니다.
그런 다음 보정 GUI 창을 닫습니다. 각 지점의 불균형한 강도를 보정하기 위해 자동으로 가중치 맵을 생성합니다. AAV 주입 마우스에 헤드 플레이트를 현미경 아래에 놓고 홀로그램 현미경과 25x 대물렌즈로 920나노미터로 조정된 모드 잠금 티타늄 사파이어 레이저를 사용하여 이광자 이미징을 수행합니다.
라이브 이미징 모드에서 상업용 이미징 소프트웨어를 엽니다. 이미지 검출기의 전압과 이미징 레이저의 파워를 조정하여 GCaMP8f를 발현하는 뉴런의 밝기를 최적화합니다. 이 단백질을 발현하는 뉴런의 이미지를 캡처합니다.
홀로그램 조명으로 특정 뉴런을 비추려면 SLMcontrol을 실행합니다. m 스크립트 파일. 참조 이미지를 클릭하고 획득한 이미지를 선택합니다.
그런 다음 스팟 버튼을 클릭하여 이미지의 뉴런에서 특정 픽셀을 선택하고 키보드의 Enter 버튼을 눌러 마무리합니다. 이미지 센서를 사용하여 높은 시간 해상도로 신경 활동을 감지하려면 노출 시간, 이미징 영역 및 비닝을 설정한 다음 이미지 획득을 수행합니다. 마우스를 현미경 아래에 놓고 이광자 이미징을 수행한 후 상용 이미징 소프트웨어를 엽니다.
라이브 이미징 모드에서 이미지 검출기의 전압과 이미징 레이저의 파워를 조정하여 GCaMP-6m-p2A-ChRmine을 발현하는 뉴런의 밝기를 최적화합니다. 이러한 단백질을 발현하는 뉴런의 이미지를 캡처한 다음 앞서 설명한 절차에 따라 특정 뉴런을 조명합니다. 레이어 2 및 3 뉴런 내의 기능적 연결성을 조사하려면 공간 광 변조기를 사용하여 광유전학적 자극의 홀로그램 패턴을 생성하고 이를 이광자 칼슘 이미징과 결합합니다.
이미징 레이저의 강도를 10 내지 20 밀리 와트에서 920 나노 미터로 설정하고, 피질 표면으로부터 100 내지 150 마이크로 미터의 깊이에서 측정 된 시야를 256 마이크로 미터 x 256 마이크로 미터로 설정한다. 픽셀 유지 시간을 2Hz의 경우 1.5마이크로초, 30Hz의 경우 100나노초로 설정합니다. 2헤르츠와 30헤르츠를 모두 이미징 프레임 속도로 사용하여 단일 홀로그램 자극이 뉴런에서 칼슘 반응을 일으켰는지 확인합니다.
단일 뉴런을 자극하는 홀로그램 자극 레이저의 강도를 신경 활동을 유도하기에 충분한 10밀리와트로 설정합니다. 동시에, 1040 나노 미터에서 10 개의 홀로그램 자극과 10 초의 기준선 기간 10 초 후 50 밀리 초 동안 8 초 간격으로 920 나노 미터에서 칼슘 철 반응을 이미지화합니다. 그런 다음 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
GCaMP8f를 발현하는 뉴런의 대표 영상과 100Hz 영상에서 홀로그램 자극과 이미지 센서로 나타낸 것입니다. 이 그래프는 각 레이저 출력에서 홀로그램 자극에 대한 신경 반응을 보여줍니다. 2 헤르츠 및 30 헤르츠 이미징 프레임 속도에서 10개의 서로 다른 뉴런을 홀로그램 자극하는 동안 대표적인 칼슘 2+ 트레이스가 여기에 제시됩니다.
같은 색은 같은 뉴런을 나타냅니다. 뉴런 간의 기능적 연결을 평가하는 개략도가 여기에 설명되어 있습니다. 주황색 뉴런이 자극을 받으면 빨간색 뉴런이 동시에 반응하여 이러한 뉴런 사이에 기능적 연결이 있음을 나타냅니다.
야생형에서 GCaMP6m을 발현하는 일차 체감각 피질 뉴런의 전형적인 이미지가 여기에 나와 있습니다. 이 그래픽 이미지는 2Hz 및 30Hz 이미징 프레임 속도에서 홀로그램 자극 동안 일반적인 Calcium 2+ 트레이스를 나타냅니다. 홀로그램 자극에 대한 신경 반응성은 2Hz 및 30Hz 이미징 속도 모두에서 감지할 수 있습니다.
이러한 단계는 뇌의 움직임을 줄이는 데 중요하며 두 가지 안정적인 결과를 얻는 데 중요합니다. 우리는 이 현미경이 특정 패턴을 가진 뉴런을 쓰는 행동을 유도할 수 있다고 믿습니다. 이 기술을 통해 우리는 이제 개별 뉴런의 활동을 평가 및 조작하고 신경 정신과를 자세히 특성화 할 수 있습니다.
