이 작품은 국립 다중 경화증에 의해 지원되었다 부여 사회 적응 및 / 또는 Davalos 외., J Neurosci 방법에서 reprinted KA 피규어와 영화 DD와 NIH / NINDS 보조금 NS051470, NS052189 및 NS066361에 RG4595A1 / T. 2008 3월 30일, Elsevier의 허가를 169 (1) :1 - 7 2,008 저작권.

1. 척추 안정화 장치를 구축 <ol><li> Narishige STS - A 콤팩트 척수 클램프 및 Narishige MA - 6N 헤드 개최 어댑터를 주문. </li><li> 사용자 정의 디자인과 척추와 꼬리가 고정되어있는 반면 동물의 머리가 지원 있도록 스테인레스 스틸베이스 플레이트는 정렬의 두 Narishige 부품을 개최합니다. 전체 장치가 일반적으로 인하 현미경 무대에서 현미경 렌즈 아래에 적합해야한다는 점에 유의하십시오. </li></ol> 2. 동물 수술 <ol><li> 미리 열 현미경의 공기 가열 장치와 챔버 37에서 유지 ° C. </li><li> 동물의 무게를 100 MG 케타민을 15 MG xylazine 및 무균 조건 하에서 0.9 % NaCl 용액에 희석 체중 kg 당 2.5 MG의 acepromazine을 사용하여 마취 혼합합니다. </li><li> 마취 혼합 (KXA) intraperitoneally을 주입하여 동물을 마취. 정기 발가락 곤란은 전반에 걸쳐 깊은 마취를 보장하기 위해 수행되어야합니다실험. 시간별 또는 필요에 따라 절반 원래의 복용과 함께 보충. </li><li> 수술을 수행하는 동안 열 지원을 제공하는 작은 동물 가열 패드를 사용합니다. </li><li> 각막 탈수 및 손상을 방지하기 위해 눈 위에 인공 눈물 연고를 적용합니다. </li><li> 트리밍 장치와 그리고 완전히 절개 주변에서 머리카락을 제거하는 날카로운 칼날로 먼저 동물의 다시 쉐이브. </li><li> 면도 머리카락을 제거하고 알코올 패드로 면도 피부 표면을 소독. </li><li> 원하는 척수 수준 (흉부 척추는 여기 참조)을 통해 피부의 작은 (~ 1.5 cm) 세로 절개를 수행합니다. </li><li> 신중하게 retracting 피하 결합 조직을하여 다시 근육을 폭로. </li><li> 조심스럽게 원하는 수준의 척추 칼럼에서 paravertebral 근육을 구분합니다. 각 spinous 과정의 양쪽에서 근육을 분리하고 분리된 근육을 밀고 가장 적은 수 incisions를 수행판상 표면에서 방법입니다. </li><li> 즉시 주동이의 및 laminectomy에 꼬리 제거 될 얇은 판을 선택하고 척추 양쪽에있는 척추 클램프에 대한 항목의 사이트를 준비합니다. 조심스럽게 클램프가 삽입됩니다 네 주머니를 만들기 위해 근육 조직을 치환. </li><li> 척수를 건드리지 않고 얇은 판 아래에있는 곡선 야기한 팁 가위 안전 삽입을 허용하기 위해 곧바로 이빨 - 팁 포셉와 척추 기포탑. 천천히 반대편에 다음 한쪽에있는 뼈 절단 및하여 laminectomy을 수행합니다. </li><li> 면봉을 사용하거나 사소한 출혈을 제한 incisions 옆에 precut 작은 gelfoam 흡수성 젤라틴 스폰지 조각을 삽입합니다. 필요한 경우 추가로 출혈을 제어하는​​ 작은 선박 cauterizer을 사용합니다. 조직을 씻어 살균 preheated 인공 뇌척수 (ACSF)를 사용합니다. </li></ol> 3. 생체내 이미징에 대한 열 및 척수 준비 안정화 <ol><li> Plac<html> E는 척추 안정화 장치의 기본 판에있는 해발 패드에 동물과 머리 들고 어댑터에 머리를 보호할 수 있습니다. </li><li> laminectomy (그림 1) 측면 미리 준비 포켓에있는 동물의 앞쪽에 - 사후 축을 따라 STS - A 장치의 척추 클램프를 놓습니다. 두 클램프는 ~ 45 각도로 배치해야 ° 노출된 척수 (그림 1) 이상의 물을 침지 렌즈를 낮추는 충분한 공간을 허용하기 위해 동물의 때리고 - 꼬리 축에 대한 상대. </li><li> 동물의 시체가 이미징 실험 (그림 1)의 기간 동안 상승 패드의 제거 후 공중에 정지 수 있도록 꼬리의 기지에서 STS - A 장치의 세 번째 클램프를 놓습니다. </li><li> ACSF에서 척수의 유지 보수 및 생체내 이미징에서이 솔루션의 현미경 렌즈의 집중을 촉진하기 위해 노출된 척수 주위 Gelseal (Amersham Biosciences 주식 회사)의 작은 우물을 빌드합니다. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. 마우스 척수의 생체내 이미징에서 두 광자 현미경과 <ol><li> 현미경을 포함 preheated 챔버 내부의 척추 안정화 장치의 동물을 전송하고 똑바로 렌즈 (그림 1)에서 laminectomy를 배치 낮아 현미경 스테이지에 안전. </li><li> ACSF 솔루션 그것은 척추 겸자 또는 Gelseal을 만지지하지 않도록해야 할로 조심스럽게 물 침지 렌즈를 낮춥니다. </li><li> 관심 영역을 식별하고 그것에 초점을 epifluorescence 사용합니다. 레이저 스캔 모드로 전환하고 fluorophores에 대한 필터가 몇 군데 조직에있는 적절한 두 광자 레이저 여기 파장, dichroics 및 대역 통과를 사용하여 생체내 이미징에서 수행합니다. </li></ol> 5. 반복적인 이미징 및 사후 수술 치료 <ol><li> 이미징 실험 끝에, 척추 안정화 장치에서 마우스를 제거하고 조심스럽게 laminectomy 주변에서 Gelseal 닦으십시오.지역을 잘 청소하십시오. </li><li> 복원하고 laminectomy 위에 다시 근육을 봉합. </li><li> laminectomy을 통해 피부를 복원하고 봉합, betadine 그것을 면봉. </li><li> 한 ML 영양 및 수화 보충 Lactated Ringers 솔루션 (박스터 헬스케어),뿐만 아니라 subcutaneously 진통 치료를 (0.1 밀리그램 / kg buprenorphine) 제공합니다. </li><li> 살균 처리 intraperitoneally을 (마우스 당 0.03 ML, 2.27 %의 enrofloxacin 주사용 항균 솔루션) 관리할 수 있습니다. </li><li> 장소 마취에서 완전히 회복까지 가열 패드에 동물과 이후 개별적으로 그것을 집. </li><li> 포스트 operatively 2-3 일동안은 수술과 진통제 치료마다 8~12시간 후 첫 3~5일 매일 살균 관리를 반복합니다. 정상적인 동작 및 전체 복구를 위해 매일 동물을 모니터링합니다. </li><li> 같은 laminectomy를 통해 다시 이미징 들어, 봉합 피부와 근육을 열고 섹션 2에서 설명한 단계를 반복 - 4. </li><li> 다시 찾을 수 previously 이전 10 설명된대로지도의 혈액 vasculature를 사용하여 지역을 몇 군데. </li></ol> 6. 대표 결과 모든 동물의 절차는 캘리포니아, 샌프란 시스코 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회가 정한 지침에 따라 수행 및 연방 규정에 따라 아르되었습니다. 척추 안정화 장치의 사진과 현미경 렌즈 아래에있는 장치에 마우스의 위치를​​ 보여주는 도식은 그림 1에 표시됩니다. 동물의 몸을 아래 호흡 움직임에 대한 충분한 공간을 허용하는 것은 척수의 생체내 이미징의 안정 보장합니다. 그것이 Cx3cr1 GFP / + 형질 전환 마우스 18 척수의 생체내에 몇 군데했습니다 그림 2 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 보여줍니다, 하는 microglia는 endogenously GFP으로 표시됩니다. 그림 3 반복 쇼 예제그것이 형광 척수 axons의 단백질 (YFP - H 라인 3)와 microglia을 (Cx3cr1 GFP / + 생쥐)를 표현 생쥐에서 동일한 척수 영역에서 수행된 같은 생체내 이미징 인치 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" /> 그림 1. 두 광자 현미경을 사용하여 생체내 이미징에 대한 마우스 척추 안정화. (A) 맞춤 제작 스틸베이스 플레이트는 STS - Narishige 컴팩트 척수 클램프와 MA - 6N Narishige를 지원하고 정렬하는 데 사용됩니다 여기에 그림과 같이 머리 어댑터를 들고. 척추 안정화 장치에 KXA 마취와 anesthetized 성인 유전자 변형 생쥐의 (B) 적절한 위치합니다. 삽입은 즉시 rostrally 및 caudally laminectomy와 노출된 척수 조직에 척추 클램프의 위치를​​ 보여줍니다. &lt;IMG 고도 = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. anesthetized 생쥐의 척수에 고밀도 microglial 세포와 혈관의 생체내 이미징에서. 의 예상하지만, 비 정렬 Z - 스택 (A) 혈관과 가까이 CX3CR1 GFP / + 마우스 (빨강, rhodamine dextran의 IV 주입으로 표시)의 척수에 높은 고밀도 GFP 양성 microglia (녹색). (B) 높은 배율 이미지 (A) 선박 주변에 확장 프로세스와 척수의 실질 향해 혈관의 벽에 붙어 하나의 microglial 세포와 같이 표시. 스케일 바, 10μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" /> 그림 3.들은 다른 일에 대한 이전 및 anesthetized 생쥐의 척수에서 reimaged 것처럼 동일한 axonal 세그먼트와 microglia의 생체내 이미징 반복. (A) YFP - 실험실<html> 일 0과 5 eled axons. (B). 그들 주위 동일한 혈관 구조와 microglial 세포가 일 0과 1 Cx3cr1 GFP / + 마우스의 척수의 생체내에 몇 군데. 스케일 바, 10μm. 영화 1. 대표 timelapse 시퀀스 마우스 척수에서 생체내에 인수했다. 이 시퀀스는 밀도가 높은 형광 구조로 채워진 조직 내에서 시간이 지남에 따라 vasculature (빨강, rhodamine dextran의 IV 주입으로 표시)과 세부 좋은 microglial 공정 역학 (녹색)과 상호 작용에 보여줍니다. RAW 이미지는 배경 노이즈, 밝기 및 대비를 위해 수정되었으며 timelapse 영화는 평균 또는 개별 비행기의 Z - 선택, 이미지 정렬하지 않고, Z - 돌출 순차적으로 획득한 이미지 스택에 의해 건설되었습니다. 혈관이 microglia의 이미지로 Z 비행기의 비슷한 범위로 이동합니다. Z 평면 깊이 : 38 μm의.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov은 &quot;&gt; 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오. 영화 2. Timelapse 시퀀스는 단일 Z - 비행기의 수준에서 이미징 메서드의 원료 안정성을 보여주는. KXA의 마취에서 척수 안정화 장치에 배치 CX3CR1 GFP / + 마우스의 척수에서 동일한 단일 Z - 비행기의 빠른 수집은보다 빠른 1 프레임 / s의 스캔 속도로 연속 프레임 사이의 최소한의 이미지 변위를 보여줍니다 마우스의 호흡 속도. 미성년자 잔여 변위 아마 심장이에 의한 것은. <a alt="Movie 2" href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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우리는 공개 아무것도 없어.

방법은 여기서 설명하는 것은 허용에 대한 안정적이고 두 광자 현미경을 사용하여 anesthetized 생쥐의 척수에서 인구 밀도가 높은 형광 세포 구조의 생체내 이미징의 반복. 달성 안정성은 맞춤 제작 척추 안정화 장치와 호흡 유발 운동 유물을 감소 마취 처방의 결과입니다. 척추 안정화 장치는 마우스 본체 아래 호흡 공간을 허용하고 상용 척추 클램프 및 헤드 장착 부분 (그림 1)를 사용하여 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Rhodamine B dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 에 희석 70 kDa, ACSF (3 % W / V) </td></tr><tr><td> 케타민을 HCL </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC 번호 : 67457-001-10 </td><td> 주사용, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> 로이드 실험실 </td><td> 나다 번호 : 139-236 </td><td> Xylazine의 주사용, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> 나다 번호 : 117-531 </td><td> 주사용, 10mg/ml </td></tr><tr><td> 인공 눈물 연고 </td><td> 피닉스 제약 </td><td> NDC 번호 : 57319-760 - 25 </td><td> 윤활유 </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 어부 </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> 맥퍼슨 - Westcott 가위 </td><td> 세계 정밀 인 스트 루먼트 </td><td> 555500S </td><td> 곡선, 야기한 팁 가위 </td></tr><tr><td> 스트레이트 집게 </td><td> 세계 정밀 인 스트 루먼트 </td><td> 555047FT </td><td> 톱니 팁 포셉 </td></tr><tr><td> 작은 용기가 부식 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, 화이자 주식 회사 </td><td> 믹서 밀 MM400 </td><td></td></tr><tr><td> 컴팩트 척수 클램프 </td><td> Narishige </td><td> STS - A </td><td></td></tr><tr><td> 머리 들고 어댑터 </td><td> Narishige </td><td> MA - 6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences 주식 회사 </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated Ringers </td><td> 박스터 헬스케어 &lt;/ TD&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser 제약 주식 회사 </td><td> NDC 번호 : 12496 - 6757-1 </td><td> Buprenorphine, 주사용 </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> 바이엘 </td><td> 나다 140-913 </td><td> Enrofloxacin, 항균 주사용 2.27 % (20ml) </td></tr><tr><td> 생리대 - 대형 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy

유전자 특정 세포 타입 2-3가 크게 생체내 4-7의 수많은 조직의 생리와 병리 학적 과정을 우리의 지식을 넓혀이에 형광 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다 생쥐 두 - 광자 현미경 하나를 사용하여 생체내 이미징에. 중추 신경계 (CNS)의 연구에서는 소설의 과다 등에 따라 뉴런, astrocytes, microglia로 세포의 행동에 대해 종종 예상치 못한 결과를 생산했다 두뇌의 생체내 이미징의 광범위한 응용 프로그램을 찾고있다 생리적 또는 병적인 상태 8-17. 그러나, 대부분 기술적인 합병증은 살아있는 마우스 척수 연구에서 생체내 이미징의의 구현을 제한합니다. 특히, 폐, 심장에 척수의 해부 가까이 이미징 살아있는 척수 도전 과제 만들어 상당한 운동 유물을 생성합니다. </P&gt; 우리는 척추를 안정화 호흡 유도 동작을 감소시키고 생체내에서 이미지를 마우스 척수를 두 광자 현미경의 사용을 촉진하여 척수 이미징의 고유의 한계를 극복 소설 방법을 개발했습니다. 이것은 호흡 유도 동작을 크게 감소 그 결과, 깊은 마취의 방법으로 사용자 정의 척추 안정화 장치를 결합하여 이루어진다. 이 비디오 프로토콜은 조직 부상을 유지하고 최소한으로 출혈하여 장시간 동안 안정적인 생리 조건 하에서 유지 수있는 살아있는 척수의 작은 영역을 노출하는 방법을 보여줍니다. 대표 원시 이미지는 고해상도의 생체내 자세히 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 인수했다. timelapse 시퀀스가​​ 살아있는 마우스 척수에있는 microglial 프로세스의 역동적인 동작을 보여줍니다. 또한, 같은 Z - 프레임의 연속 스캔이 입증이 방법은 이미지 정렬 후 획득을 필요로하지 않는 이미지 및 / 또는 timelapse 영화 스택을 생성 달성할 수있는 뛰어난 안정성의. 마지막으로, 우리는 생체내에 지속적인 생리적 또는 병적인 프로세스 종단 연구 있으므로이 방법은 나중에 timepoints에서 척수의 동일한 영역을 다시 방문하고 reimage하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서 프로토콜<em&gt; 생체내에</em두 광자 현미경을 사용하여&gt; 척수 이미징이 설명되어 있습니다. 이 방법은 호흡 유발 움직임을 최소화하고 더 정렬 또는 후처리 다른 필요하지 원시 영상 자료를 생산하기 위해 척추 안정화 장치와 마취 처방을 결합한 제품입니다.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

23.8K 조회수.  University of California, San Francisco. 마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서 프로토콜 생체내에 척수 이미징이 설명되어 있습니다. 이 방법은 호흡 유발 움직임을 최소화하고 더 정렬 또는 후처리 다른 필요하지 원시 영상 자료를 생산하기 위해 척추 안정화 장치와 마취 처방을 결합한 제품입니다.

비디오: In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

연구

신경과학

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...