이 프로토콜은 비선형 현미경 검사법에 관심이 있는 과학자가 자극된 라만 산란을 기반으로 하는 현미경의 주요 구성 요소, 설정 및 정렬 절차를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. SRS 현미경 검사법의 주요 장점은 진동 대비에 따라 라벨이 없는 이미징을 수행하고 몇 초 만에 이미지를 획득하는 능력입니다. SRS 현미경 검사는 세포 와 세포 건축에 근본적인 지질과 같은 복잡한 생물학 구조물의 새로운 높이에 레이블 없는 화상 진찰을 취했습니다.
SRS 신호는 프로브 빔의 강도의 작은 변화로 감지되고 소음에 의해 손상될 수 있습니다. 따라서 정확한 기호는 매우 중요합니다. 시작하려면 OPO와 티타늄 사파이어 레이저 빔을 정렬하여 모두 현미경에 도달하십시오.
다음으로 레이저 빔 위치 센서의 검출기를 이색 거울 1개와 미러 6 사이에 두 위치에 배치합니다. 첫 번째 위치는 이색 거울 에 가깝게 위치하고 두 번째 위치는 거울 6에 가깝습니다. 각 위치에 대해 센서를 사용하여 OPO 빔의 X 및 Y 좌표를 감지합니다.
중요한 것은 티타늄 사파이어 레이저 빔의 X 및 Y 좌표가 센서 검출기의 두 위치에서 동일한 OPO인지 확인합니다. 일부 위치에서 좌표가 일치하지 않는 경우 인접한 미러의 기울기를 조정하여 보정합니다. 이 같은 절차를 따라 티타늄 사파이어 빔 위치를 OPO와 관련하여 미러의 6번과 7사이의 경로를 정렬합니다.
미러 6과 7 사이에 플립 플롭 마운트에 미러를 추가로 설치하고 미러 마운트를 뒤집어 빔을 오토콜렐레이터로 안내합니다. 오토코렐레이터 컨트롤러의 전원을 제어하고, 이를 제어하는 컴퓨터에서 소프트웨어 응용 프로그램을 시작하고, 오토콜렐레이터의 빔 거리 조정 나사를 8.35밀리미터의 정상 위치로 설정합니다. 그런 다음 티타늄 사파이어 빔을 멈추고 OPO 빔을 추가 미러에서 오토콜렐레이터의 입력 미러로 방출 및 투영합니다.
여기에 표시된 대로 레이저 펄스 신호를 최대화하기 위해 입력 미러를 조정하십시오. 그런 다음 OPO 빔을 멈추고 플립플롭 장착 거울에서 입력 거울및 오토콜렐레이터로 티타늄 사파이어 빔을 방출하고 투영합니다. 여기에 표시된 오토코렐레이터 신호가 얻어질 때까지 최적의 빔 조정을 반복한다.
이제 빔 거리 조정 나사를 7.30밀리미터의 크로스 위치로 설정합니다. 빔을 모두 해제하고 지연된 선을 스캔하여 두 빔을 겹치게 합니다. 여기에 표시된 바와 같이 결과 교차 장내 신호를 가져옵니다.
그런 다음 플립 플롭 장착 거울을 뒤집어 빔이 미러 7과 현미경의 스캔 헤드에 도달 할 수 있도록합니다. 응축기를 제거하고 이스케이프 버튼을 사용하여 60배 주관렌즈를 일시적으로 철회합니다. 그런 다음 코 조각을 회전하여 60배 주관성 렌즈를 광학 경로에서 이동합니다.
다음으로, 외부 기계식 마운트를 사용하여 현미경의 상부에 검출기를 장착한다. 50 옴 로우 패스 필터를 통해 검출기의 출력을 오실로스코프에 연결합니다. 이제 스캐너 헤드를 제어하는 프로세서를 켜고 OPO 빔을 현미경의 스캐너 헤드에 투사합니다.
OPO 신호를 모니터링하고 XY 변환기를 사용하여 검출기에 의해 측정된 전력을 최대화합니다. 그런 다음 OPO 레이저에서 티타늄 사파이어 레이저로 빔을 전환하고 티타늄 사파이어 레이저에 대한 신호도 얻어지는지 확인합니다. 이는 두 빔이 잘 정렬되어 있음을 나타냅니다.
60x 주관적인 코를 다시 회전하여 빔 정렬을 마무리합니다. 그런 다음 현미경의 재초점 버튼을 사용하여 60x 현미경 목표 렌즈에 대한 최종 초점을 되찾는다. 마지막으로, 샘플을 만지거나 방해하지 않고 응축기 대신 에 40배의 배율로 목표를 배치합니다.
두 빔에 대해 현미경 전에 측정된 티타늄 사파이어 및 OPO 레이저의 힘을 30밀리와트로 설정합니다. 이어서, OPO 레이저의 파장을 다른 값으로 설정하여, 이전 레이저에 대하여, 펌프와 프로브가 구슬의 진동 주파수와 공진되지 않도록 한다. 다음으로, 두 빔을 방출하여 현미경으로 입력합니다.
스캐닝 지연 라인 전산화된 번역기를 실행하고 지연 선의 각 위치에 대한 잠금 증폭기를 사용하여 측정된 강도를 기록합니다. 지연 라인 스캔이 완료될 때까지 기다립니다. 이제 OPO의 파장을 1076 나노미터로 설정하여 펌프와 프로브가 구슬의 진동 주파수와 공진하도록 합니다.
스캐닝 지연 라인 전산화된 번역기를 실행하고 지연 라인 스캔이 완료될 때까지 기다립니다. 마지막으로, 자극라만 산란 이미지의 다음 획득을 위해 획득된 중첩 빔 위치와 지연 선을 설정합니다. 빔의 공간 동기화를 최적화하려면 티타늄 사파이어 빔을 중지하고 OPO 전력을 8밀리와트로 감소시키는 것으로 시작합니다.
다음으로 검출기 판독기를 데이터 수집 카드에 연결합니다. 현미경 스캐닝 콘솔과 함께 데이터 수집 프로그램을 실행합니다. 완료되면 파일을 저장하고 데이터를 처리하여 여기에 표시된 것과 같은 이미지를 가져옵니다.
다음으로 OPO 빔을 멈추고 티타늄 사파이어 전력을 2.5~4.5밀리와트로 줄입니다. 감지기를 잠금 증폭기및 판독기와 데이터 수집 카드와 연결합니다. 그런 다음 현미경 스캐닝 콘솔과 함께 데이터 수집 프로그램을 다시 실행합니다.
완료되면 파일을 저장하고 데이터를 처리하여 여기에 표시된 것과 같은 이미지를 가져옵니다. 펌프 펄스를 제거하고 스토크 신호만 획득하기 위해 40배 목표와 포토다이오드 사이에 필터 스택을 도입합니다. 그런 다음 펌프 신호를 8밀리와트의 집중 전력으로 810 나노미터로 설정합니다.
프로브 신호를 8밀리와트의 동일한 집중 전력으로 1076 나노미터로 설정하여 라만 시프트 3054 역 센티미터의 전형적인 탄소 수소 결합을 조사합니다. 감지기를 잠금 증폭기와 잠금 증폭기의 판독을 데이터 수집 카드에 연결합니다. 마지막으로 현미경 프로그램에서 픽셀 형식 및 획득 시간을 설정하고 이를 실행하고 데이터 수집 시스템을 실행하여 매트릭스 파일이 완료되면 저장합니다.
샘플의 단일 지점에서 의 예제 측정이 여기에 표시됩니다. 빔이 시이나 공간에서 겹치지 않으면, 얻어진 결과는 공진을 벗어났으며, 여기서 잠금 증폭기로 측정된 신호의 진폭은 0입니다. 그러나 이 신호의 단계는 음수값과 양수 값 사이로 이동합니다.
빔이 공간에서 겹치면 빔이 제 시간에 완벽하게 겹칠 때 신호가 증가하고 최대값에 도달하면 위상이 빔이 겹치는 동안 고정값을 달성하기 시작합니다. 전송 이미지에서, 단일 빔이 사용되고 샘플로부터 의 전송된 빔 강도는 포토다이오드에 의해 측정된다. 왼쪽에서는, 전송 화상은 OPO를 사용하여 얻어졌고, 오른쪽에있는 동안, 전송 이미지는 티타늄 사파이어를 사용하여 얻어졌다.
SRS 이미지의 전형적인 예는 여기에 표시되며, 직경이 3 마이크로미터인 폴리스티렌 구슬의 라벨이 없는 이미지가 보고됩니다. SRS 현미경 검사법을 기반으로 고품질 의 이미지를 얻기 위해 현미경의 정렬이 중요합니다. 따라서 프로토콜의 모든 표시된 단계는 신중하게 수행되어야 합니다.
