세포 내 분해능과 화학적 특이성을 가진 생물학적 조직의 생체 내 이미징은 세포 대사, 면역 반응 및 조직 리모델링과 관련된 동적 과정을 이해하는 강력한 도구입니다. 이광자 형광과 자극된 라만 산란 현미경을 결합하면 세포 내 분해능을 통해 생물학적 조직의 중요한 생화학적 및 생물물리학적 정보를 여러 관점에서 획득할 수 있습니다. 특히,이 이중 모달 현미경 검사는 신경 퇴행성 질환 및 척수 손상의 진행을 연구하기 위해 마우스 척수에서 세포 역학 및 상호 작용을 이미지화하는 데 사용될 수 있습니다.
시작하려면 키 스위치를 대기 모드에서 켜짐 위치로 전환하여 티타늄 사파이어 레이저를 켜고 레이저가 예열될 때까지 30분 동안 기다립니다. 그런 다음 OPO 제어판의 시작 버튼을 클릭하여 OPO를 켜고 레이저가 예열될 때까지 20분 동안 기다립니다. 피코초 레이저가 예열되면 스톡스 빔의 전력을 약 20밀리와트로 낮추고 스토크스 빔의 레이저 셔터를 열고 OPO 출력에 고속 사진 검출기를 배치하여 빔을 감지하여 스토크스 빔의 변조 깊이를 확인합니다.
그런 다음 BNC 커넥터가있는 동축 케이블을 사용하여 광검출기의 출력 포트를 오실로스코프의 입력 포트에 연결하여 레이저 펄스를 모니터링하십시오. 그런 다음 OPO 제어 소프트웨어에서 EOM 제어 창을 열고 오실로스코프에 표시된 펄스 강도 다이어그램에 따라 EOM 전력 및 위상을 조정하여 20메가헤르츠에서 최대 변조 깊이를 달성합니다. OPO 제어 소프트웨어에서 Stokes 출력을 중지하면서 펌프 레이저 셔터를 엽니다.
그런 다음 신호 설정 상자를 클릭하여 펌프 빔의 파장을 796 나노 미터로 설정 한 다음 OPO 전원 상자 설정을 클릭하고 20을 입력하여 광 정렬을 위해 전력을 최소로 설정하십시오. 다음으로, 편광 빔 스플리터 뒤에 정렬 플레이트 P1을 약 10cm로 놓고 P1 뒤에 플레이트 P2를 광학 경로의 약 30cm로 배치합니다. 피코초 레이저 빔의 현미경 셔터를 연 후 미러 M1을 조정하여 P1의 관통 구멍에서 피코초 레이저 빔 중심을 찾습니다. 적외선 스코프를 사용하여 미러 M1을 조정할 때 P1에서 빔 스폿의 위치를 관찰하십시오. 마찬가지로, 미러 M2를 조정하여 P2의 관통 구멍에서 피코초 레이저 빔 중심을 찾습니다. 적외선 스코프를 사용하여 미러 M2를 조정할 때 P2에서 빔 스폿의 위치를 관찰하십시오. 피코초 빔 중심이 두 정렬 플레이트의 관통 구멍에 위치 할 때까지 거울을 조정 한 후 현미경 제어 소프트웨어에서 피코초 빔의 셔터를 닫습니다.
다음으로, 펨토초 레이저 빔의 현미경 셔터를 엽니다. 미러 M3을 조정하여 P1의 관통 구멍에서 펨토초 레이저 빔 스폿 중심을 찾은 다음 미러 M4를 조정하여 P2의 관통 구멍에서 펨토초 레이저 빔 스폿 중심을 찾습니다. 펨토초 레이저 빔 중심이 두 정렬 플레이트의 관통 구멍에 위치할 때까지 미러를 조정한 후 펨토초 빔의 현미경 셔터를 닫습니다. 다음으로, 목표의 위치에 카메라를 배치하여 두 빔 지점의 위치를 시각화하고 카메라 화면에 펌프 빔의 위치를 참조로 표시합니다.
그런 다음 렌즈 L3 앞에 정렬 플레이트 P0을 놓고 육각 키를 사용하여 광학 미러 하나를 조정하여 스톡스 빔 중심이 레이저 출력 포트에서 정렬 플레이트의 관통 구멍을 통과하도록하십시오. 적외선 범위를 사용하여 조정 중에 P0에서 빔 스폿의 위치를 확인합니다. 그런 다음 정렬 플레이트 P0을 제거하고 육각 키를 사용하여 광학 미러 두 개를 조정하여 Stokes 빔의 중심이 카메라의 펌프 빔의 참조 표시와 함께 함께 로컬링되도록 합니다.
Stokes 빔이 P0 및 카메라 평면의 펌프 빔과 엄격하게 겹칠 때까지 미러를 계속 조정하십시오. 잠금 증폭기 제어 소프트웨어를 열고 펌프 레이저의 파장을 796나노미터로, 펌프 및 스토크스 빔의 전력을 샘플에서 각각 15밀리와트 및 25밀리와트에 해당하는 50 및 70밀리와트로 설정합니다. 그런 다음 잠금 증폭기 위상 최적화를 위해 올리브 오일을 사용하십시오.
올리브 오일은 신호 다시 산란 또는 EPI-SRS 검출을 향상시키기 위해 바닥에 부착 된 티슈 페이퍼로 슬라이드에 밀봉됩니다. 올리브 오일 샘플을 무대에 놓고 25X 목표의 초점을 샘플에 조정하십시오. 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 텍스트 원고에 언급 된 이미징 매개 변수를 설정하십시오.
그런 다음 잠금 증폭기 제어 소프트웨어를 사용하여 시간 상수 값을 10마이크로초로 설정합니다. 다음으로, 샘플 위에 레이저 빔을 스캔하여 SRS 신호 강도가 최대에 도달할 때까지 22.5도의 스텝 크기로 위상을 튜닝합니다. 그런 다음 레이저 셔터가 닫힌 상태에서 샘플을 스캔하고 평균 SRS 신호가 0에 가까워질 때까지 한 밀리볼트의 스텝 크기로 오프셋 값을 튜닝합니다.
다음으로, OPO 제어 소프트웨어에서 지연 관리자 대화 상자를 열고 올리브 오일을 스캔하여 올리브 오일 SRS 신호가 최대에 도달 할 때까지 지연 단계를 조정하십시오. 그런 다음 스캔을 중지하고 지연 관리자 대화 상자에서 데이터 추가 버튼을 클릭하여 현재 지연 데이터를 기록하십시오. 다양한 화학 샘플을 이미징하여 서로 다른 라만 시프트에서 지연 데이터를 유사하게 획득한 후, 지연 관리자 대화상자에서 다섯 번째 순서로 적합한 데이터를 선택하여 현재 데이터 포인트를 다섯 번째 차수 다항식 함수에 맞춥니다.
그런 다음 사용자 정의로 사용 버튼을 클릭하고 확인란을 선택하여 적합 데이터를 적용합니다. 지연 단계는 적합 지연 곡선에 따라 다른 파장에서 자동 조정됩니다. 생체 내 이미징의 경우, 척수가 노출되고 식염수에 담근 상태에서 안정화 단계에서 마우스를 고정시킵니다.
이제 안정화 단계를 TPEF-SRS 현미경 아래의 다섯 축 스테이지에 장착합니다. 그런 다음 두 개의 헤드 막대로 마우스 헤드를 고정하고 홀딩 플레이트를 내려 호흡 중 가슴 운동을위한 충분한 공간을 제공하여 모션 아티팩트를 완화시킵니다. 다음으로, 척수 혈관구조의 Brightfield 이미지가 10X 목표 하에서 관찰될 수 있을 때까지 초점을 조정하도록 Z-번역 단계를 조정한다.
다섯 축 단계의 두 축 번역 단계를 조정하여 시야의 중앙에 척수 등정맥을 찾습니다. 다음으로, 다섯 축 스테이지의 롤 및 피치 각도를 조정하여 Brightfield 이미지를 기반으로 목표 축에 수직인 척수 등쪽 표면을 조정합니다. 그런 다음 10X를 TPEF-SRS 이미징을 위한 25X 수침 목표로 교체합니다.
SRS 이미징의 경우, 전동 플리퍼에 연결된 스위치 버튼을 눌러 목표 위의 편광 빔 스플리터를 선택합니다. TPEF 이미징의 경우 전동 플리퍼에 연결된 스위치 버튼을 눌러 목표 위의 이색성 미러 D2를 선택합니다. 마지막으로 텍스트 원고에 설명된 대로 이미징 매개 변수를 설정하고 샘플 스캔을 시작합니다.
마우스 척수에서 드물게 표지된 YFP 축색돌기와 미엘린 외피의 생체내 이중 모달 영상은 축삭이 미엘린 외피의 두꺼운 층에 의해 밀접하게 감싸져 있음을 밝혀냈다. TPEF-SRS 척수 이미지에서 볼 수 있듯이, 랜비어의 노드는 축삭 직경이 감소하고 겨드랑이마는 세포외 매트릭스에 직접 노출된다. 형광 및 SRS 이미징을 위한 새로운 프로브와 결합하여 이광자 여기된 형광 SRS 현미경은 다양한 생체 분자의 구조적 및 기능적 이미징을 동시에 달성하여 복잡한 생물학적 과정에 대한 이해를 촉진할 수 있습니다.
