이 프로토콜은 일관된 안티 스토크스 라만 산란과 자극 된 라만 산란 과정을 포함하여 가장 널리 사용되는 두 가지 하이퍼 스펙트럼 코히어런트 라만 산란 기술을 비교하며, 이를 통해 생물 학자들은 생물학적 응용에 가장 적합한 이미징 양식을 선택할 수 있습니다. 고유 진동 시그니처를 사용하여 일관된 라만 분광법은 외인성 라벨링 없이도 화학 정보와 생물학적 샘플을 매핑 할 수 있습니다. Coherent Raman 현미경 검사는 세포 대사, 매핑, 약물 분포, 질병 진단 및 화학적 변화 정량화에 대한 우리의 이해를 넓혔습니다.
이것은 광학 및 분광법 모두에서 충분한 훈련이 필요한 기술입니다. 이 기술을 사용하기 전에 몇 가지 리뷰 기사를 읽고 전문가의 교육을 받는 것이 좋습니다. 시작하려면 양면 테이프 조각을 커버 슬립 위에 놓고 테이프 중간에서 테이프의 작은 직사각형 모양을 잘라 샘플이 배치 될 열린 영역을 만들어 이미징 슬라이드를 준비하십시오.
1 내지 2 마이크로리터의 순수한 DMSO를 피펫팅하고 공석의 중앙에 액적을 분배한다. 조심스럽게 상단 덮개 슬립을 놓고 DMSO 샘플이 테이프의 가장자리에 닿지 않도록 하면서 커버 슬립의 가장자리를 부드럽게 놓아 챔버를 밀봉합니다. 감도 실험을 위해, 중수소 산화물에서 DMSO의 연속 희석물을 준비하여 50 ~ 0 %의 농도 범위를 제공하고 각 용액의 1 ~ 2 마이크로 리터를 취하여 이전에 입증 된대로 압축 샘플을 준비하십시오.
샘플을 현미경 스테이지에 놓고 대물 렌즈 또는 응축기에 필요한 경우 물 또는 침지 오일을 첨가하십시오. 시야각에서 DMSO 액적의 가장자리를 적절하게 움직이고 대물 렌즈를 조정하여 최상의 초점을 맞춘 다음 Kohler 조명 방법을 사용하여 콘덴서를 중앙에 맞추고 콘덴서의 다이어프램을 완전히 엽니 다. 다음으로, 펌프 빔 파장을 800나노미터로 조정하여 2913 파장 CH3 피크를 표적으로 하고, 반파판을 조정하여 펌프와 스토크스 빔의 전력을 현미경 전에 약 30밀리와트로 설정한다.
SRS의 경우 잠금 증폭기 게인을 7마이크로초의 시간 상수로 약 10으로 설정하여 시간 상수가 픽셀 유지 시간보다 작도록 합니다. 약 100x100 평방 마이크로미터의 스캔 크기로 픽셀 번호 200 x 200을 사용하여 이미지 획득 파라미터 및 획득 소프트웨어를 설정하고, 이미지에 DMSO 액적과 빈 영역이 모두 포함되어 있는지 확인한 다음, 샘플을 스캔하고 컴퓨터 화면에서 이미지를 확인합니다. 다음으로, 실시간 이미지를 모니터링하면서 Stokes 펌프 빔에서 전동식 지연 이미지를 스캔하고 신호가 최대화 될 때까지 지연 시간을 통해 스캔하십시오.
DMSO 액적을 움직여 전체 시야각을 덮고 신호가 펌프 빔에 따라 최대 DC 신호가 이미지의 중앙에 집중되어 있는지 확인하십시오. 미러를 통해 펌프 빔의 위치를 조정하거나 이미징 소프트웨어에서 전압 오프셋을 조정합니다. DC 최적화 후 채도가 이미지의 중앙에 집중되어 있는지 확인하는 동안 임계값을 조정하여 약 50% 채도를 표시하도록 임계값을 조정하여 AC 신호가 최대화될 때까지 Stokes 빔 미러를 조정합니다.
그렇지 않은 경우 Stokes 빔에서만 미러를 미세 조정하고 정렬 중에 신호를 모니터링하여 정렬 품질에 대한 실시간 피드백으로 모니터링합니다. SNR 분석의 경우 ImageJ 소프트웨어를 열고 파일을 클릭한 다음 가져오기를 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 텍스트 이미지 및 열기 옵션을 클릭하여 저장된 DMSO 샘플 텍스트 파일을 가져옵니다. 이미지를 가져온 후 Control Shift C를 눌러 밝기 및 대비 기능을 표시한 다음 DMSO 샘플의 영역이 포화되어 나타날 때까지 밝기 및 대비 기능에서 자동 단추를 눌러 최대 샘플 신호를 찾습니다.
그런 다음 ImageJ 인터페이스에서 타원형 선택 도구를 클릭하고 포화 DMSO 영역의 작은 영역을 강조 표시합니다. 강조 표시한 후 M을 눌러 선택한 영역의 평균 및 표준 편차를 측정합니다. 배경을 측정하려면 빈 영역의 신호가 관찰될 때까지 밝기 및 대비 기능에서 막대를 조정한 다음 타원형 선택을 클릭하고 배경의 영역을 강조 표시하여 선택한 영역에 DMSO가 포함되어 있지 않은지 확인합니다.
그런 다음 M을 눌러 선택한 영역의 통계를 측정합니다. 다음으로, 표준 편차와 함께 잡음 평균값 및 신호 평균값을 측정하여 이전에 입증된 바와 같이 SNR을 계산한다. 하이퍼스펙트럼 CRS 이미지를 처리하려면 파일을 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 가져오기, 텍스트 이미지 및 열기 옵션을 클릭하여 텍스트 파일을 가져옵니다.
가져온 후 이미지, 스택을 클릭 한 다음 도구 및 몽타주를 스택으로 클릭하여 파일을 이미지 스택으로 변환 한 다음 첫 번째 DMSO 피크가 표시 될 때까지 몽타주를 스크롤합니다. DMSO에서 영역을 선택하고 이미지를 클릭한 다음 스택 및 플롯 Z축 프로파일 옵션을 클릭하여 강도 대 프레임 번호 스펙트럼을 플로팅합니다. 그런 다음 목록을 클릭하고 프로파일 데이터를 복사하여 원시 스펙트럼 데이터를 추출하십시오.
복구된 스펙트럼을 주파수 단위로 변환하려면 DMSO 및 해당 프레임 번호에서 늘어나는 대칭 및 비대칭 CH를 사용하여 선형 회귀를 수행하십시오. DMSO의 스펙트럼 분해능은 하이퍼스펙트럼 SRS 및 CARS 현미경을 사용하여 측정되었으며, 이는 각각 14.6 및 17.1 파수의 분해능을 보여주며, 이는 SRS가 더 나은 스펙트럼 분해능을 갖는다는 것을 나타낸다. DMSO SRS 스펙트럼은 0.1 및 0.01% 농도에서 얻어졌으며, 여기서 2913 파수에서의 피크는 전자에서는 분해될 수 있지만, 후자에서는 그렇지 않으며, 검출 한계가 0.1 내지 0.01%DMSO 사이임을 나타낸다.
위상 검색된 CARS 스펙트럼은 DMSO 2913 파수 피크가 0.1%DMSO에 대해 명확하게 분해될 수 있음을 보여주지만, 이들 두 농도 사이의 검출 한계를 나타내는 0.01%는 아니다. MIA PaCA-2 셀의 SRS 및 CARS 강도 프로파일은 SRS 신호가 398.6 나노 미터의 분해능을 제공하는 반면 CARS 신호는 330.3 나노 미터의 1.2 배 더 나은 분해능을 제공한다는 것을 입증했습니다. 서로 다른 광학 지연 위치에 있는 MIA PaCa-2 셀의 SRS 및 CARS 이미지는 SRS의 밝은 점으로 지질 방울이 있는 가장 강한 신호를 보여 주는 반면, CARS는 콘트라스트가 훨씬 감소했습니다.
그러나, 스펙트럼 포커싱에서 37 파수 적색 이동은 SRS 및 CARS 둘 다에 대한 지질 콘트라스트를 개선시켰다. SRS 스펙트럼은 다른 소기관보다 지질 방울에 대해 2850 파수에서 훨씬 더 강한 신호를 보여주는 반면, CARS 스펙트럼은 작은 적색 시프트를 보여줍니다. 일관된 라만 산란 신호를 최적화하려면 먼저 샘플 초점을 찾은 다음 광학 지연을 조정하고 마지막으로 최대값이 달성 될 때까지 미러를 미세 조정하십시오.
과도 흡수와 같은 다른 펌프 프로브 기술은 본질적으로 CRS 플랫폼에 통합됩니다. 이 기술은 강한 빛을 흡수하는 비형광 분자의 흡수 동역학을 측정하는데 매우 강력하다. 이 기술을 통해 연구자들은 높은 화학 세포 활성을 가진 라벨이없는 방식으로 작은 분자를 볼 수 있습니다.
또한 연구원은 지질 대사, 세포 내 역학 및 약물 분포의 변화를 볼 수 있습니다.
