시험관 내 전사 RNA 기반 루시파라제 분석법에 대한 당사의 프로토콜은 두우스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구하는 데 도움이 됩니다. 또한 Poly(A) 리터의 사용자 지정 길이를 사용하면 번역에 대한 규제 효과를 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 mRNA의 5'UTR 및 3'UTR 및 광범위한 번역 개시와 같은 Cis 요소에 의한 번역 조절연구를 허용한다는 것입니다.
시험관 내 전사 RNA 기반 루시파라제 기자 분석은 캡 및 기타 수정에 대한 수정을 통합하도록 조정되어 번역에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 시작하려면 앞으로 의 선상 및 역방향 프라이머를 설계하여 5'to 3'direction:T7-Promoter에서 다음 요소를 포함하는 PCR 앰플리션을 생성합니다. 폴리(A)리터, T7_12A-Fluc라고 불리는 폴리(A) 꼬리의 반딧불 루시파제 ORF는 앞으로 프라이머에 몇 가지 추가 뉴클레오티드를 포함하고 있으며, 그 다음으로 T7-Promoter Poly(A) 리터 또는 원하는 5'UTR 서열 및 약 20개의 뉴클레오티드가 리포터 유전자의 ORF의 5엔드에 대응하는 것을 포함한다. 리포터 유전자의 ORF의 5엔드에 해당하는 용융 온도에 기초하여 프라이머 길이를 조정하여 프라이머내의 해당 영역이 유전자의 감각 가닥과 동일하도록 한다.
그런 다음 폴리(A)꼬리와 약 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 역프라이머를 설계한다. 리포터 유전자의 ORF의 3엔드에 해당하는 용융 온도에 기초하여 조정하여 프라이머의 해당 영역이 유전자의 안티센스 가닥과 동일하고 프레임 내 스톱 코돈이 폴리(A) 꼬리 앞에 존재하도록 한다. 내부 제어를 위해 5'to 3'direction:T7-Promoter, 코작 시퀀스를 포함하는 무작위 5'UTR 코딩 시퀀스, 레닐라 루시파아제 ORF 및 폴리(A)꼬리의 다음 요소를 포함하는 다른 프라이머 세트를 설계하여 T7_Kozak-Rluc라고 합니다.
반응을 설정하려면, PCR 튜브에 다음 순서로 시약을 추가: DNase 무료 물, 2배 높은 충실도 DNA 폴리머라제, 프라이머 및 서열 확인 루시포어 템플릿 DNA. 표준 3단계 PCR 주기후 DNA 템플릿을 생성한 후, 분자량 표준과 함께 1%아가로산 TAE 겔 전기포광에서 PCR 반응의 5-10%를 실행하여 PCR 제품을 검출한다. PCR 제품의 크기를 확인하려면 UV 조명기 아래에서 젤을 시각화합니다.
PCR 제품의 정확한 크기를 결정한 후, DNA를 용해시키기 위해 100 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터를 사용하여 시판되는 PCR 정화 키트를 사용하여 정제한다. 분광광계를 사용하여 정제 된 DNA의 농도를 확인하고 즉시 체외 전사에 사용하기 위해 영하 20도에서 저장하십시오. PCR 제품으로부터 RNA를 합성하기 위해, 마이크로센심분리기 튜브에 다음과 같은 시약을 추가하십시오: DNase-RNase 무료 물, NTP 버퍼 믹스, 캡 아날로그, PCR 제품 템플릿 및 시험관 내 전사 키트의 T7-RNA 폴리머라제 믹스.
완전히 섞으세요. 2시간 동안 섭씨 37도에서 배양한 다음 RNA 정화 키트를 사용하여 합성된 RNA의 정제를 진행한다. 정제된 RNA를 확인하려면 RNA를 5분 동안 70도에서 가열하여 이차 구조를 제거하고 1.5 아가로즈 TBE 젤로 실행합니다.
그런 다음 UV 조명기 아래에서 젤을 시각화합니다. 분광광계를 사용하여 정제 된 RNA의 농도를 확인하십시오. 알리쿼트하고 영하 80도에 보관하십시오.
24개의 웰 플레이트에 있는 종자 HeLa 세포는 다음 날 80-90%의 합류를 달성하고 이산화탄소 5%의 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 하룻밤을 배양합니다. 5의 감염의 복합성에 Vaccinia 바이러스로 HeLa 세포를 감염하고 비교를 위해 감염되지 않은 HeLa 세포를 유지합니다. 그런 다음 10~12시간 동안 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다.
원하는 시간 후 감염 후, 혼합 480 12A 서열 베어링 반딧불 루시파제 mRNA와 코자크 서열 베어링 코자크 서열의 20 나노그램 한 마이크로 센트심분리기 튜브에. 또 다른 미세 원심 분리관에서 양이온 지질 경질 시약의 1.1 마이크로 리터를 추가하십시오. 55 마이크로리터의 감소된 혈청 매체를 두 튜브에 넣고 실온에서 5분간 배양합니다.
그런 다음 튜브를 포함하는 mRNA에 감소된 혈청 매체를 포함하는 55개의 마이크로리터 양이온 지질 경질 시약을 추가합니다. 피펫과 부드럽게 섞고 실온에서 15분간 배양합니다. 인큐베이션 하는 동안, 세포 배양 배지를 세포로부터 제거하고 잘 당 감소된 혈청 배지의 400 마이크로리터를 추가한다.
인큐베이션이 완료되면, 혼합물의 100 마이크로리터를 넣고 24웰 플레이트의 웰당 현명하고 균등하게 떨어뜨립니다. 12A Fluc 및 Kozak Rluc mRNA와 5시간 후 의 결합 후, 세포로부터 감소된 혈청 배지를 제거하고 2개의 리포터 분석제를 수행할 수 있는 루시파아제 분석 키트로부터 150마이크로리터 1X 리시스 버퍼를 추가하여 세포를 용해시킨다. 실온에서 10분 동안 배양한 후 고무와 멸균 주사기를 사용하여 세포를 긁어 내고 미세 원심분리기 튜브로 옮김합니다.
세포 파편을 펠릿하기 위해, 12, 000 배 g에서 4섭씨에서 10 분 동안 lysate을 원심분리합니다. 불투명한 벽으로 둘러싸인 96의 웰당 30 마이크로리터를 단단한 바닥으로 옮기는 흰색 분석 플레이트. 루시파라제 분석 키트와 다중 모드 플레이트 판독기 조명계를 사용하여 원고에 설명된 바와 같이 운동 기능을 사용하여 이중 발광을 측정합니다.
발광 판독 데이터를 바람직한 파일 형식으로 내보낸 후, 플루크 값을 내부 제어 Rluc 값으로 나누어 감염되지 않은 및 VACV 감염 된 HeLA 세포에서 12A Fluc mRNA에서 상대 적 번역 속도를 결정합니다. 이 분석은 감염되지 않은 및 VACV 감염 된 세포에 5'Poly (A) 리터를 포함하는 Fluc mRNA의 번역 효율을 테스트하는 데 사용되었다. 감염되지 않은 및 VACV 감염된 세포는 모두 성공적으로 Fluc 및 Rluc mRNA와 공동 으로 감염되었습니다.
Rluc에 의해 Fluc를 분할하면 세포의 RNA 안정성에서 형질 전환 효율을 정규화했습니다. mRNA를 함유하는 5'Poly(A) 리터는 감염되지 않은 세포에 비해 VACV 감염 시 번역이 이점이 있다. 이는 RNA 수준이 감염되지 않은 및 VACV 감염 세포에서 5시간 후 mRNA 경질 후 유사했기 때문에 차분성 경피 효율 또는 mRNA 안정성 때문이 아니었다.
이는 PCR 반응 효율뿐만 아니라 증폭된 DNA를 요구하는 모든 다운스트림 프로세스에도 영향을 줄 수 있기 때문에 프라이머를 설계할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이 방법은 Cis 요소에 의한 번역 규정을 신속하게 테스트하는 중요한 분석입니다. 가능하면 이 메서드는 다른 보완 실험에 의해 확증되어야 합니다.
예방 조치는 바치니아 바이러스를 사용하는 동안 취해야하며 에디듐 브로마이드및 페놀과 같은 화학 물질에 노출되지 않아야합니다.
