Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.

1 샘플 준비 <ol><li> 96 - 웰 플레이트에 적정 및 전송을위한 루시 페라 제 발현 바이러스 (예를 들어 본원 VSVΔ51-Fluc)를 포함하는 샘플을 얻습니다. 대안 적으로, 직접적으로 96 웰 조직 배양 플레이트를 사용 상청액에서 감염을 수행한다. </li><li> 표준 곡선의 포함에 대한 처리되지 않은 두 개의 열을 둡니다. 나중에 -80 ° C 및 역가의 실험 (40 시간 게시물 감염) 또는 저장소의 말에 96 - 웰 플레이트, 역가에서 직접 수행 실험하십시오. </li></ol> 바이러스 적정 허용 세포의 2 준비 <ol><li> 24 시간 전에 titering하여, 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 둘 베코 변형 된 이글 배지에서 2.5 × 105 세포 / ml (DMEM) (FBS), 30 mM의 HEPES의 농도 베로 세포의 현탁액을 제조하고, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. NOTE :이 프로토콜은 베로 세포를 사용하지만, VSV 감염 임의의 적절한 허용 세포주 ㄴ 수전자를 사용합니다. </li><li> 마이크로 디스펜서를 사용하여 96 - 웰 백색 고체 평면 바닥 플레이트에 2.5 × 104 세포 (100 μL)을 시드. <ol><li> 접시 당 세포 현탁액의 12 ML 플러스 프라이밍 5 ML을 준비합니다. </li><li> 멸균 물 50 ㎖로 튜브를 세척함으로써 클린 마이크로 디스펜서 카세트. </li><li> 세포 현탁액을 가진 마이크로 디스펜서 라인을 작성하고 세포 현탁액의 5 ㎖를 통해 흐름을 보자. </li><li> 흰색 벽으로 둘러싸인 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 μl를 분배하는 프로그램을 선택합니다. 분배 및 추가 판에 필요한 반복합니다. 불투명 바닥 흰색 벽 플레이트 세포 건강과 밀도의 확인을 위해 사용되는 경우 또한 96 웰 분명 바닥이 평평한 접시에 몇 우물을 시드. </li><li> 다시 원래의 용기에 완료, 세척 세포. 튜브를 통해 멸균 따뜻한 물 50 ㎖ 다음에 70 % 에탄올 50 ㎖를 실행하여 카세트를 청소한다. </li><li> 확인 카세트와 튜브가 AP 해적절히 설계된 사용 사이의 청소. </li></ol></li><li> 가습 된 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 품어. </li></ol> 바이러스 성 표준 곡선의 3 준비 <ol><li> 108 PFU / ㎖, 107 PFU / ㎖를 : 무 혈청 DMEM에서 VSVΔ51-Fluc의 표준 곡선을 준비 예컨대 다음과 같이 베로 세포 상 전사 후의 ML 당 플라크 형성 단위 (PFU)의 최종 농도가 있음 10 6 PFU / ㎖, 10 5 PFU / ㎖, 104 PFU / ㎖, 103 PFU / ㎖, 10 2 PFU / ㎖, 및 10 일 PFU / ㎖. 베로 세포의 플레이트 플러스 추가 10 % 당 각 농도의 50 μl를 준비합니다. NOTE : 루시퍼 라제 스톡 바이러스 역가의 절대 정량 있도록 표준 곡선을 생성하기 위해 고전적인 방법 (10)에서 평가 될 필요가있다. 그렇지 않으면 상대 정량 임의로 설정하여 바이러스 역가를 역가 정확한 정보없이 달성 될 수있는 기초희석 단계에. 예를 들어 표준 곡선의 처음의 희석은 10 8 바이러스 단위 및 10 7 등으로 희석 10.1 이하로 설정 될 수있다. 이러한 맥락에서, 하나는 정확하지 않을 절대적인 정량화로서 미리 결정된 샘플과 비교하여 배의 변화와 같은 값을 표현한다. </li></ol> 허용 세포 상에 샘플 상층 액의 4 전송 <ol><li> 단일 층은 적어도 95 % 합류임을 확인 광학 현미경 클리어 바닥 96 - 웰 플레이트에 도금 베로 세포를 확인한다. </li><li> 흰색 벽 플레이트 시드 베로 세포에 샘플 상층 액의 25 μl를 전송합니다. 표준 곡선에 대해 지정된 2 열로 상층 액을 전송하지 마십시오. NOTE :이 96 - 채널 액체 핸들러를 사용하여 단일 플레이트의 모든 웰에 대해 동시에 수행 될 수있다. </li><li> 8 또는 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여,의 베로 세포를 3 단계에서 제조 된 표준 곡선의 각 희석액 25 μL를 추가이 지정된 열. </li><li> RT에서 430 XG에 5 분 동안 원심 분리 판. </li><li> 가습 된 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 5 시간 동안 품어. </li></ol> 세포 생존 능력의 평가 (5) <ol><li> NOTE : 맑은 96 웰 플레이트에서 수행 감염 실험에서 얻은 상청액으로부터 시작하는 경우, 샘플은 생존 레사 주린으로 세포 생존의 지시 염료와 정량화하기 전에 평가 될 수있다. </li><li> 바이러스와 세포를 함유하는 샘플의 96 - 웰 플레이트의 각 웰의 체적의 10 %에 상당하는 양으로 레사 주린 추가. 셀 전용 각각 100 %와 0 %의 생존율에 대한 값을 결정하기 위해 미디어 전용 제어뿐만 아니라 제어 포함한다. </li><li> 2-4 시간 (세포 유형과 염료의 시판 또는 재구성 된 파우더의 농도에 따라 달라질 것이다 배양 시간) 후, 판독 및 형광 플레이트 리더 (530-560 여기, 590 방출)을 이용하여 신호를 기록한다. 보고서 셀 viabiliX 100 % 상대 화학식 대사 활동 = - (- 네거티브 제어 신호) / (셀에만 신호를 제어 네거티브 제어 신호) (시험 샘플 신호)에 따른 샘플 TY </li></ol> 루시페린 기판의 6 준비 <ol><li> 30 분, 5 시간의 배양이 종료되기 전에, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 2 ㎎ / ㎖ 용액을 얻었다 루시페​​린을 준비. 접시 당 2.5 ㎖의 플러스 여분이 ML을 준비합니다. 빛으로부터 솔루션을 보호합니다. 참고 : 루시페린는 이전 일에서 준비하고 사용할 때까지 4 ° C에서 저장 될 수있다. </li></ol> 7 독서 생물 발광 <ol><li> 5 시간의 잠복기 후, 백색 고체 플레이트 베로 세포의 각 웰에 루시페린의 25 μl를 추가합니다. 수동으로 또는 루미에 통합 자동 디스펜서와 루시페린을 추가합니다. NOTE : 단지 하나의 단부 지점과 함께 기기의 사용은 루시페라아제 호환 용해 버피의 첨가가 필요할 수 읽FER 일관성을 개선하기 루시페린 기질을 첨가하기 전에. </li><li> 다음 매개 변수를 사용하여 번호판을 읽기 : <ol><li> 5 초 동안 흔들어. </li><li> 30 초를 기다립니다. </li><li> 적절한 고정 감도 / 노출 값에서 발광을 읽어보십시오. 옵션이 기기에 사용할 수있는 경우, 멀티 포인트의 정확성을 개선하기 위해 (예를 들면, 3 × 3 행렬을) 읽고 사용하십시오. </li></ol></li><li> 기록 및 정량 생물 발광 강도를 저장합니다. </li><li> 자동 디스펜서를 추가하는 데 사용 된 경우 루시페린은 루시페린 프라임 따뜻한 멸균 물 라인을 제거. </li></ol> 제 데이터 분석 <ol><li> 정확한 결과를 위해, 표준 곡선으로부터 힐 방정식을 생성하기 위해 비선형 회귀를 해결한다. 바이러스 성 표현 단위를 계산하는 titered 샘플이 방정식을 적용합니다. 일부 바이러스 나 상황이 선형 관계로 표준 곡선을 생성 할 수있다; 이러한 경우에 선형 방정식 해결. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 루시퍼 라제 기반 접근 용이성, 신속, 최소 장비 필요성, 및 비교적 낮은 비용을 포함하는 다른 기존의 방법에 비해 많은 장점을 제공한다. 이 키에 기여 시리얼 희석 단계의 회피이다. 그럼에도 불구하고,이 용액을 희석 프로토콜 기반 유도체 확실히 가능하며, 최근 높은 처리량 바이러스 화면 (11)에 루시 페라 제 발현 에볼라 역가를 평가하는데 사용 하였다. 본질적으로 더 많은 시간이 소요되고 비용이 더 필요한 경우이지만, 이러한 적응 바이러스 정량 큰 동적 범위를 제공 할 수있다. 높은 처리량 스크린의 문맥에서의 바이러스 역가를 평가하기에 특히 적합 할뿐만 아니라, 우리 원스텝 루시페라아제 기반 바이러스 정량화 방법은 바이러스 복제의 경우의 감염성 비리 온의 정확한 추정치를 생성한다. 또한, 동일한 실험에서 세포 독성 데이터와 함께 발광의 판독은 더 줄표적 세포에 대한 실험 조건의 효과의 완전한 그림은, 온 콜리 틱 바이러스 및 약물 스크린의 맥락에서 특히 유용하다. 여기에 도시 된 예는 하나의 복제 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 사용한다; 그러나이 프로토콜은 프로토콜 약간 작은 조정과 바이러스를 복제 및 비 복제 수에 적응 될 수있다. 이는 우두, HSV와 AAV (그림 5 참조)와 같은 DNA 바이러스를 포함한다. 예컨대 백시 니아 바이러스와 같은 세포 내 바이러스 감염 샘플, 종래 정량 (예를 들면, 적어도 하나의 동결 - 해동주기)에 바이러스 분리 단계를 필요로한다. 다른 바이러스에이 기술을 적용하면, 루미 의해 번호판의 판독에 바이러스 상등액 또는 파쇄물의 전송에서 배양 시간을 최적화 할 필요가있다. 이 파라미터는 허용 세포주에서 바이러스의 복제주기 및 P의 강도에 주로 의존 할 것이다romoter 루시 페라 제 발현을 운전. 이것은 가장 최적화 단계에서 완전한 표준 곡선을 사용하여 수행된다. 이를 위해, 하나의 제조 표준 곡선의 여러 복제물을 가진 적절한 허용 세포주를 감염 후의 전사 포인트 각각은 서로 다른 시간에 복제 읽어야한다. 이상적으로, 배양 시간 점은 예상되는 시료 역가 범위에 걸친 LOG (RLU) 및 LOG (역가) 사이의 선형 관계로 연결이 선택된다. VSVΔ51-Fluc의 경우,이는 전형적으로 10 4 PFU / ㎖ -10 7 PFU / ㎖ 5 시간의 배양 시간에 대한. 낮거나 높은 역가가 샘플로부터 예상되는 경우, 하나는 단순히 증가 또는 각각 배양 시간을 줄일 수있다. 대안 적으로, 샘플을 ELISA에 대해 통상적으로 수행되는 많은 범위로 희석 될 수있다. 전술 한 바와 같이,이 방법은 물론 대부분의 단계가 자동화 될 수있는 약물 라이브러리를 이용하여 높은 처리량 약물 스크린을 수행하기에 적합하다. 세포는 전자 도금 할 수 있습니다fficiently 자동화 마이크로 디스펜서를 사용하여, 약물 라이브러리는 96 - 채널 액체 핸들러를 사용하여 첨가 할 수 있으며,이 바이러스는 마이크로 디스펜서를 사용하여 추가 될 수 있고, 플레이트는 자동화 루미로 읽을. 이론적으로,이도 384도 이하의 포맷으로 구성 될 수있다; 그러나이 마지막에 제한은 도금 될 수있는 셀의 수, 주어진 적은 세포 (역가) 관계를 로그에 LOG (RLU)의 선형성에 좁은 범위에 이르게됩니다. 마지막으로, 또는 다른 레사 주린 염료를 사용하여 대사 세포 생존 능력의 평가를 쉽게 바이러스 12과 함께 상승적 바이러스 사멸로 이어질 스크린 또는 화합물의 식별에서 세포 독성 화합물의 차별을 허용 흐름에 혼입 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법의 한계는 항상 가능한 것은 아니다 루시퍼 라제 유전자 발현하는 바이러스의 요구 사항, 및 충분히 허용 세포주의 이용을 포함한다. 그러나, 적응 가능한 가능성다른 리포터 유전자와 함께 사용하기위한 방법 (예를 들면, GFP)는 리포터 정량화 방법 잡음비 적당한 선형성 및 신호가 제공. 전반적으로 기재된 하이 스루풋 방법은 다양한 바이러스에 맞도록 수정 및 다양한 애플리케이션에 맞추어 질 수있다.

Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive &#8220;plaquing&#8221; cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9. 
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV&#8710;51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbeccos&#39; Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NorthBio Inc.</td>
			<td>NBSF-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:136px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEPES</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310-1</td>
			<td style="width:251px;">Prepare a&#160; 1mM solution, pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alamarBlue&#160;</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>BUF012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Luciferin potassium salt</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3917</td>
			<td style="width:251px;">384-well plates can also be used for higher throughput</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy Mx</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>SMTBL</td>
			<td>Monochromator microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquidator96</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>LIQ-96-200</td>
			<td>96 tip manual pipetting system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:136px;">LQR-200F</td>
			<td style="width:251px;">Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microflo</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>111-206-21</td>
			<td>Used to plate cells in a 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5210450</td>
			<td>Microplate fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput titration of luciferase-expressing recombinant viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

높은 처리량 방법을 설명하는 흐름의 개요는도 1에 도시되어있다. 2 전형적인 표준 곡선 ofVSVΔ51-Fluc의 결과를 보여준다. 비선형 회귀 분석을 네 매개 변수는 알 수없는 입력 PFU (바이러스 역가 추정치)를 삽입 할 수있는 힐 플롯을 생성합니다. 이러한 추정 역가는 불린다 바이러스 발현 단위 (VEU). 그림 3a는 VEUs 및 역가가 동일한 샘플 (10)와 표준 플라크 분석을 수행하여 얻은 보여줍니다. 샘플은 다양한 화학 물질이 복제를 향상시키는 데 사용 및 786-0 세포에서 VSVΔ51-Fluc의 확산되었다 실험에서 유래. 표준 곡선으로부터 내삽 VEUs이 샘플 상청액의 희석에 기초한 계수를 곱한해야는 베로 세포에 전송되고 (이 경우, 희석 배수 5이다). 역가와 VEU 사이의 선형 상관 관계는 그림 3b에 도시된다 </strong&gt; R 0.8083의 2와 0.899 (P &lt;0.0001)의 피어슨의 연구 점수와 함께. 그림 4에서, 대사 분석에서 얻은 일반적인 세포 독성 데이터는 이전 VSVΔ51-Fluc 감염에 화학 물질로 처리 786-0 세포에 대해 표시됩니다. 마지막으로, 그림 5는 다양한 바이러스를 얻을 일반적인 표준 곡선 (단순 포진 바이러스 (HSV), 백시 니아 바이러스 및 아데노 - 관련 바이러스 (AAV), 모든 표현 반딧불 루시 페라 제)를 표시하고 필요에 따라, 배양 시간 및 동결 융해에 대해 설명합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> VSV Δ 51-Fluc를 사용하여 높은 처리량 바이러스 titering 및 세포 독성 분석의 그림 1 워크 플로우. 37 ° C에서 (A) 씨도 (100 μL) 당 2.5 × 10 4 베로 세포를 배양한다. (B) (24)시간 후 전송 베로 세포에 대한 표준 곡선의 25 μL (접시 당 2 열). (C) 전송은 샘플의 25 μL은 나머지 베로 세포에 titered합니다. 원심 분리기 판과는 잘 37 ° C. (D)에 볼륨의 10 %에 상당하는 금액에서 부화 원래의 샘플을 포함하는 판에 레사 주린 시약을 추가합니다. , 5 시간 후 (F). 세포 독성을 읽고 기록 형광 및 평가, 3 시간 후 37 ° C. (E)에서 번호판을 품어 베로 세포의 각 웰에 루시페린의 2 ㎎ / ㎖ 용액 25 μl를 추가합니다. 발광을 읽고 바이러스 성 표현 단위를 계산합니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2는 VSV Δ 51-Fluc의 표준 곡선을 예상. 루시 페라 제 발현 나였잘 루미를 사용하여 생물 발광이 평균 상대 라이트 유닛 (RLU)로 표현 된 내 다섯 가지 지점에서 5 시간 후 상등액 전송을 asured. RLU 의미하는 것은 공지의 입력에 대해 플롯 하였다 PFU / ㎖ 비선형 회귀를 해결하고 힐 방정식을 생성한다. 이 복제 곡선과 표준 오차 막대의 평균 (R = 0.9993이에게) 표시됩니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> 도 높은 처리량 방법에 의해 수득 된 것과 표준 플라크 분석 역가 비교 3. (A) VEU / ㎖ 사이의 PFU / ㎖ 높은 처리량 루시페라아제 분석법을 이용 titered 동일 샘플로부터 계산 된 바이러스 역가 (VEU / ㎖)과 비교 하였다 베로 세포에 대한 표준 플라크 분석에 의해 얻어진. (B) 선형 관계에 바이러스 역가 및 역가 표준 페이지를 통해 획득laque 분석. 선형 회귀 곡선과 결정 (R 2)의 계수를 나타낸다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4 샘플 생존. 베로 세포 상에 뜨는 전송이 시판 레사 주린 용액을 이용하여 세포의 신진 대사 활동을 평가하여 결정 하였다 샘플 생존 이전에. 원시 형광 값은 치료, 감염되지 않은 우물의 정규화 하였다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5는 HSV, 우두 및 AAV 바이러스 표준 곡선을 예상. 루시 페라 제 표현이 잘 루미를 사용하여 내 다섯 다른 지점에서 측정 한 생물 발광이 평균 침착 하 발현되었다TIVE 광 단위 (RLU). (A) HSV 표준 곡선은 베로 세포에 첨가하고 17 시간 후 supernantant 전송 (R이되었다 :도 (100 μL) 및 루시페라아제 측정 당 2.5 × 104 세포의 밀도로 24 시간 이전 도금 = 0.9489, N = 1). 힐 방정식은 비선형 회귀를 해결함으로써 생성 하였다. (B) 백시 표준 곡선은 베로 세포에 첨가하고 잘 (100 μL) 당 2.5 × 104 세포에 24 시간 이전 밀도 도금 및 37 ℃에서 2.5 시간 동안 인큐베이션 C, 후 루시 페라 측정 찍은 (R 2 = 0.9892). 선형 방정식은 선형 회귀에 대해 해결함으로써 생성 하였다. (C) AAV 표준 곡선은 인간의 폐암 세포 (A549) 상에 첨가하고 잘 (100 μL) 및 루시페라아제 측정 당 2.5 × 104 세포의 밀도로 24 시간 이전 도금 24 시간 후 감염되었다. 힐 방정식은 비선형 회귀를 해결함으로써 생성 하였다. 평균오 복제 곡선과 표준 오차 막대가 표시됩니다의 (R 2 = 0.9926).

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High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K 조회수.  Ottawa Hospital Research Institute. This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

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High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

연구

생물학

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 Cryohistology

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...