Name: high-throughput titration of luciferase-expressing recombinant viruses
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses at JoVE.com

Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.

1 샘플 준비 <ol><li> 96 - 웰 플레이트에 적정 및 전송을위한 루시 페라 제 발현 바이러스 (예를 들어 본원 VSVΔ51-Fluc)를 포함하는 샘플을 얻습니다. 대안 적으로, 직접적으로 96 웰 조직 배양 플레이트를 사용 상청액에서 감염을 수행한다. </li><li> 표준 곡선의 포함에 대한 처리되지 않은 두 개의 열을 둡니다. 나중에 -80 ° C 및 역가의 실험 (40 시간 게시물 감염) 또는 저장소의 말에 96 - 웰 플레이트, 역가에서 직접 수행 실험하십시오. </li></ol> 바이러스 적정 허용 세포의 2 준비 <ol><li> 24 시간 전에 titering하여, 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 둘 베코 변형 된 이글 배지에서 2.5 × 105 세포 / ml (DMEM) (FBS), 30 mM의 HEPES의 농도 베로 세포의 현탁액을 제조하고, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. NOTE :이 프로토콜은 베로 세포를 사용하지만, VSV 감염 임의의 적절한 허용 세포주 ㄴ 수전자를 사용합니다. </li><li> 마이크로 디스펜서를 사용하여 96 - 웰 백색 고체 평면 바닥 플레이트에 2.5 × 104 세포 (100 μL)을 시드. <ol><li> 접시 당 세포 현탁액의 12 ML 플러스 프라이밍 5 ML을 준비합니다. </li><li> 멸균 물 50 ㎖로 튜브를 세척함으로써 클린 마이크로 디스펜서 카세트. </li><li> 세포 현탁액을 가진 마이크로 디스펜서 라인을 작성하고 세포 현탁액의 5 ㎖를 통해 흐름을 보자. </li><li> 흰색 벽으로 둘러싸인 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 μl를 분배하는 프로그램을 선택합니다. 분배 및 추가 판에 필요한 반복합니다. 불투명 바닥 흰색 벽 플레이트 세포 건강과 밀도의 확인을 위해 사용되는 경우 또한 96 웰 분명 바닥이 평평한 접시에 몇 우물을 시드. </li><li> 다시 원래의 용기에 완료, 세척 세포. 튜브를 통해 멸균 따뜻한 물 50 ㎖ 다음에 70 % 에탄올 50 ㎖를 실행하여 카세트를 청소한다. </li><li> 확인 카세트와 튜브가 AP 해적절히 설계된 사용 사이의 청소. </li></ol></li><li> 가습 된 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 품어. </li></ol> 바이러스 성 표준 곡선의 3 준비 <ol><li> 108 PFU / ㎖, 107 PFU / ㎖를 : 무 혈청 DMEM에서 VSVΔ51-Fluc의 표준 곡선을 준비 예컨대 다음과 같이 베로 세포 상 전사 후의 ML 당 플라크 형성 단위 (PFU)의 최종 농도가 있음 10 6 PFU / ㎖, 10 5 PFU / ㎖, 104 PFU / ㎖, 103 PFU / ㎖, 10 2 PFU / ㎖, 및 10 일 PFU / ㎖. 베로 세포의 플레이트 플러스 추가 10 % 당 각 농도의 50 μl를 준비합니다. NOTE : 루시퍼 라제 스톡 바이러스 역가의 절대 정량 있도록 표준 곡선을 생성하기 위해 고전적인 방법 (10)에서 평가 될 필요가있다. 그렇지 않으면 상대 정량 임의로 설정하여 바이러스 역가를 역가 정확한 정보없이 달성 될 수있는 기초희석 단계에. 예를 들어 표준 곡선의 처음의 희석은 10 8 바이러스 단위 및 10 7 등으로 희석 10.1 이하로 설정 될 수있다. 이러한 맥락에서, 하나는 정확하지 않을 절대적인 정량화로서 미리 결정된 샘플과 비교하여 배의 변화와 같은 값을 표현한다. </li></ol> 허용 세포 상에 샘플 상층 액의 4 전송 <ol><li> 단일 층은 적어도 95 % 합류임을 확인 광학 현미경 클리어 바닥 96 - 웰 플레이트에 도금 베로 세포를 확인한다. </li><li> 흰색 벽 플레이트 시드 베로 세포에 샘플 상층 액의 25 μl를 전송합니다. 표준 곡선에 대해 지정된 2 열로 상층 액을 전송하지 마십시오. NOTE :이 96 - 채널 액체 핸들러를 사용하여 단일 플레이트의 모든 웰에 대해 동시에 수행 될 수있다. </li><li> 8 또는 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여,의 베로 세포를 3 단계에서 제조 된 표준 곡선의 각 희석액 25 μL를 추가이 지정된 열. </li><li> RT에서 430 XG에 5 분 동안 원심 분리 판. </li><li> 가습 된 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 5 시간 동안 품어. </li></ol> 세포 생존 능력의 평가 (5) <ol><li> NOTE : 맑은 96 웰 플레이트에서 수행 감염 실험에서 얻은 상청액으로부터 시작하는 경우, 샘플은 생존 레사 주린으로 세포 생존의 지시 염료와 정량화하기 전에 평가 될 수있다. </li><li> 바이러스와 세포를 함유하는 샘플의 96 - 웰 플레이트의 각 웰의 체적의 10 %에 상당하는 양으로 레사 주린 추가. 셀 전용 각각 100 %와 0 %의 생존율에 대한 값을 결정하기 위해 미디어 전용 제어뿐만 아니라 제어 포함한다. </li><li> 2-4 시간 (세포 유형과 염료의 시판 또는 재구성 된 파우더의 농도에 따라 달라질 것이다 배양 시간) 후, 판독 및 형광 플레이트 리더 (530-560 여기, 590 방출)을 이용하여 신호를 기록한다. 보고서 셀 viabiliX 100 % 상대 화학식 대사 활동 = - (- 네거티브 제어 신호) / (셀에만 신호를 제어 네거티브 제어 신호) (시험 샘플 신호)에 따른 샘플 TY </li></ol> 루시페린 기판의 6 준비 <ol><li> 30 분, 5 시간의 배양이 종료되기 전에, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 2 ㎎ / ㎖ 용액을 얻었다 루시페​​린을 준비. 접시 당 2.5 ㎖의 플러스 여분이 ML을 준비합니다. 빛으로부터 솔루션을 보호합니다. 참고 : 루시페린는 이전 일에서 준비하고 사용할 때까지 4 ° C에서 저장 될 수있다. </li></ol> 7 독서 생물 발광 <ol><li> 5 시간의 잠복기 후, 백색 고체 플레이트 베로 세포의 각 웰에 루시페린의 25 μl를 추가합니다. 수동으로 또는 루미에 통합 자동 디스펜서와 루시페린을 추가합니다. NOTE : 단지 하나의 단부 지점과 함께 기기의 사용은 루시페라아제 호환 용해 버피의 첨가가 필요할 수 읽FER 일관성을 개선하기 루시페린 기질을 첨가하기 전에. </li><li> 다음 매개 변수를 사용하여 번호판을 읽기 : <ol><li> 5 초 동안 흔들어. </li><li> 30 초를 기다립니다. </li><li> 적절한 고정 감도 / 노출 값에서 발광을 읽어보십시오. 옵션이 기기에 사용할 수있는 경우, 멀티 포인트의 정확성을 개선하기 위해 (예를 들면, 3 × 3 행렬을) 읽고 사용하십시오. </li></ol></li><li> 기록 및 정량 생물 발광 강도를 저장합니다. </li><li> 자동 디스펜서를 추가하는 데 사용 된 경우 루시페린은 루시페린 프라임 따뜻한 멸균 물 라인을 제거. </li></ol> 제 데이터 분석 <ol><li> 정확한 결과를 위해, 표준 곡선으로부터 힐 방정식을 생성하기 위해 비선형 회귀를 해결한다. 바이러스 성 표현 단위를 계산하는 titered 샘플이 방정식을 적용합니다. 일부 바이러스 나 상황이 선형 관계로 표준 곡선을 생성 할 수있다; 이러한 경우에 선형 방정식 해결. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 루시퍼 라제 기반 접근 용이성, 신속, 최소 장비 필요성, 및 비교적 낮은 비용을 포함하는 다른 기존의 방법에 비해 많은 장점을 제공한다. 이 키에 기여 시리얼 희석 단계의 회피이다. 그럼에도 불구하고,이 용액을 희석 프로토콜 기반 유도체 확실히 가능하며, 최근 높은 처리량 바이러스 화면 (11)에 루시 페라 제 발현 에볼라 역가를 평가하는데 사용 하였다. 본질적으로 더 많은 시간이 소요되고 비용이 더 필요한 경우이지만, 이러한 적응 바이러스 정량 큰 동적 범위를 제공 할 수있다. 높은 처리량 스크린의 문맥에서의 바이러스 역가를 평가하기에 특히 적합 할뿐만 아니라, 우리 원스텝 루시페라아제 기반 바이러스 정량화 방법은 바이러스 복제의 경우의 감염성 비리 온의 정확한 추정치를 생성한다. 또한, 동일한 실험에서 세포 독성 데이터와 함께 발광의 판독은 더 줄표적 세포에 대한 실험 조건의 효과의 완전한 그림은, 온 콜리 틱 바이러스 및 약물 스크린의 맥락에서 특히 유용하다. 여기에 도시 된 예는 하나의 복제 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 사용한다; 그러나이 프로토콜은 프로토콜 약간 작은 조정과 바이러스를 복제 및 비 복제 수에 적응 될 수있다. 이는 우두, HSV와 AAV (그림 5 참조)와 같은 DNA 바이러스를 포함한다. 예컨대 백시 니아 바이러스와 같은 세포 내 바이러스 감염 샘플, 종래 정량 (예를 들면, 적어도 하나의 동결 - 해동주기)에 바이러스 분리 단계를 필요로한다. 다른 바이러스에이 기술을 적용하면, 루미 의해 번호판의 판독에 바이러스 상등액 또는 파쇄물의 전송에서 배양 시간을 최적화 할 필요가있다. 이 파라미터는 허용 세포주에서 바이러스의 복제주기 및 P의 강도에 주로 의존 할 것이다romoter 루시 페라 제 발현을 운전. 이것은 가장 최적화 단계에서 완전한 표준 곡선을 사용하여 수행된다. 이를 위해, 하나의 제조 표준 곡선의 여러 복제물을 가진 적절한 허용 세포주를 감염 후의 전사 포인트 각각은 서로 다른 시간에 복제 읽어야한다. 이상적으로, 배양 시간 점은 예상되는 시료 역가 범위에 걸친 LOG (RLU) 및 LOG (역가) 사이의 선형 관계로 연결이 선택된다. VSVΔ51-Fluc의 경우,이는 전형적으로 10 4 PFU / ㎖ -10 7 PFU / ㎖ 5 시간의 배양 시간에 대한. 낮거나 높은 역가가 샘플로부터 예상되는 경우, 하나는 단순히 증가 또는 각각 배양 시간을 줄일 수있다. 대안 적으로, 샘플을 ELISA에 대해 통상적으로 수행되는 많은 범위로 희석 될 수있다. 전술 한 바와 같이,이 방법은 물론 대부분의 단계가 자동화 될 수있는 약물 라이브러리를 이용하여 높은 처리량 약물 스크린을 수행하기에 적합하다. 세포는 전자 도금 할 수 있습니다fficiently 자동화 마이크로 디스펜서를 사용하여, 약물 라이브러리는 96 - 채널 액체 핸들러를 사용하여 첨가 할 수 있으며,이 바이러스는 마이크로 디스펜서를 사용하여 추가 될 수 있고, 플레이트는 자동화 루미로 읽을. 이론적으로,이도 384도 이하의 포맷으로 구성 될 수있다; 그러나이 마지막에 제한은 도금 될 수있는 셀의 수, 주어진 적은 세포 (역가) 관계를 로그에 LOG (RLU)의 선형성에 좁은 범위에 이르게됩니다. 마지막으로, 또는 다른 레사 주린 염료를 사용하여 대사 세포 생존 능력의 평가를 쉽게 바이러스 12과 함께 상승적 바이러스 사멸로 이어질 스크린 또는 화합물의 식별에서 세포 독성 화합물의 차별을 허용 흐름에 혼입 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법의 한계는 항상 가능한 것은 아니다 루시퍼 라제 유전자 발현하는 바이러스의 요구 사항, 및 충분히 허용 세포주의 이용을 포함한다. 그러나, 적응 가능한 가능성다른 리포터 유전자와 함께 사용하기위한 방법 (예를 들면, GFP)는 리포터 정량화 방법 잡음비 적당한 선형성 및 신호가 제공. 전반적으로 기재된 하이 스루풋 방법은 다양한 바이러스에 맞도록 수정 및 다양한 애플리케이션에 맞추어 질 수있다.

Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive &#8220;plaquing&#8221; cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9. 
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV&#8710;51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos&#039; Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>Prepare a 1 mM solution, pH 7.3</td></tr><tr><td>alamarBlue&amp;nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin potassium salt</td><td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr><tr><td>96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>384-well plates can also be used for higher throughput</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>Monochromator microplate reader</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>Mettler Toledo</td><td>LIQ-96-200</td><td>96 tip manual pipetting system</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters</td><td>Mettler Toledo</td><td>LQR-200F</td><td>Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>Used to plate cells in a 96-well plate</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td><td>Microplate fluorometer</td></tr></tbody></table>

high-throughput titration of luciferase-expressing recombinant viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

높은 처리량 방법을 설명하는 흐름의 개요는도 1에 도시되어있다. 2 전형적인 표준 곡선 ofVSVΔ51-Fluc의 결과를 보여준다. 비선형 회귀 분석을 네 매개 변수는 알 수없는 입력 PFU (바이러스 역가 추정치)를 삽입 할 수있는 힐 플롯을 생성합니다. 이러한 추정 역가는 불린다 바이러스 발현 단위 (VEU). 그림 3a는 VEUs 및 역가가 동일한 샘플 (10)와 표준 플라크 분석을 수행하여 얻은 보여줍니다. 샘플은 다양한 화학 물질이 복제를 향상시키는 데 사용 및 786-0 세포에서 VSVΔ51-Fluc의 확산되었다 실험에서 유래. 표준 곡선으로부터 내삽 VEUs이 샘플 상청액의 희석에 기초한 계수를 곱한해야는 베로 세포에 전송되고 (이 경우, 희석 배수 5이다). 역가와 VEU 사이의 선형 상관 관계는 그림 3b에 도시된다 </strong&gt; R 0.8083의 2와 0.899 (P &lt;0.0001)의 피어슨의 연구 점수와 함께. 그림 4에서, 대사 분석에서 얻은 일반적인 세포 독성 데이터는 이전 VSVΔ51-Fluc 감염에 화학 물질로 처리 786-0 세포에 대해 표시됩니다. 마지막으로, 그림 5는 다양한 바이러스를 얻을 일반적인 표준 곡선 (단순 포진 바이러스 (HSV), 백시 니아 바이러스 및 아데노 - 관련 바이러스 (AAV), 모든 표현 반딧불 루시 페라 제)를 표시하고 필요에 따라, 배양 시간 및 동결 융해에 대해 설명합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> VSV Δ 51-Fluc를 사용하여 높은 처리량 바이러스 titering 및 세포 독성 분석의 그림 1 워크 플로우. 37 ° C에서 (A) 씨도 (100 μL) 당 2.5 × 10 4 베로 세포를 배양한다. (B) (24)시간 후 전송 베로 세포에 대한 표준 곡선의 25 μL (접시 당 2 열). (C) 전송은 샘플의 25 μL은 나머지 베로 세포에 titered합니다. 원심 분리기 판과는 잘 37 ° C. (D)에 볼륨의 10 %에 상당하는 금액에서 부화 원래의 샘플을 포함하는 판에 레사 주린 시약을 추가합니다. , 5 시간 후 (F). 세포 독성을 읽고 기록 형광 및 평가, 3 시간 후 37 ° C. (E)에서 번호판을 품어 베로 세포의 각 웰에 루시페린의 2 ㎎ / ㎖ 용액 25 μl를 추가합니다. 발광을 읽고 바이러스 성 표현 단위를 계산합니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2는 VSV Δ 51-Fluc의 표준 곡선을 예상. 루시 페라 제 발현 나였잘 루미를 사용하여 생물 발광이 평균 상대 라이트 유닛 (RLU)로 표현 된 내 다섯 가지 지점에서 5 시간 후 상등액 전송을 asured. RLU 의미하는 것은 공지의 입력에 대해 플롯 하였다 PFU / ㎖ 비선형 회귀를 해결하고 힐 방정식을 생성한다. 이 복제 곡선과 표준 오차 막대의 평균 (R = 0.9993이에게) 표시됩니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> 도 높은 처리량 방법에 의해 수득 된 것과 표준 플라크 분석 역가 비교 3. (A) VEU / ㎖ 사이의 PFU / ㎖ 높은 처리량 루시페라아제 분석법을 이용 titered 동일 샘플로부터 계산 된 바이러스 역가 (VEU / ㎖)과 비교 하였다 베로 세포에 대한 표준 플라크 분석에 의해 얻어진. (B) 선형 관계에 바이러스 역가 및 역가 표준 페이지를 통해 획득laque 분석. 선형 회귀 곡선과 결정 (R 2)의 계수를 나타낸다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4 샘플 생존. 베로 세포 상에 뜨는 전송이 시판 레사 주린 용액을 이용하여 세포의 신진 대사 활동을 평가하여 결정 하였다 샘플 생존 이전에. 원시 형광 값은 치료, 감염되지 않은 우물의 정규화 하였다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5는 HSV, 우두 및 AAV 바이러스 표준 곡선을 예상. 루시 페라 제 표현이 잘 루미를 사용하여 내 다섯 다른 지점에서 측정 한 생물 발광이 평균 침착 하 발현되었다TIVE 광 단위 (RLU). (A) HSV 표준 곡선은 베로 세포에 첨가하고 17 시간 후 supernantant 전송 (R이되었다 :도 (100 μL) 및 루시페라아제 측정 당 2.5 × 104 세포의 밀도로 24 시간 이전 도금 = 0.9489, N = 1). 힐 방정식은 비선형 회귀를 해결함으로써 생성 하였다. (B) 백시 표준 곡선은 베로 세포에 첨가하고 잘 (100 μL) 당 2.5 × 104 세포에 24 시간 이전 밀도 도금 및 37 ℃에서 2.5 시간 동안 인큐베이션 C, 후 루시 페라 측정 찍은 (R 2 = 0.9892). 선형 방정식은 선형 회귀에 대해 해결함으로써 생성 하였다. (C) AAV 표준 곡선은 인간의 폐암 세포 (A549) 상에 첨가하고 잘 (100 μL) 및 루시페라아제 측정 당 2.5 × 104 세포의 밀도로 24 시간 이전 도금 24 시간 후 감염되었다. 힐 방정식은 비선형 회귀를 해결함으로써 생성 하였다. 평균오 복제 곡선과 표준 오차 막대가 표시됩니다의 (R 2 = 0.9926).

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High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.8K 조회수.  Ottawa Hospital Research Institute. This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

연구

면역학 및 감염병학

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

암 연구학

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Lentivirus 제작

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

생물학

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Biosafety 수준 2 설정에 높게 병원 성 Coronaviruses 공부 Pseudotyped 입자의 생산

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

유사형 바이러스를 이용한 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화도 평가

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

저자 스포트라이트: Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (유사형 바이러스와의 숙주 바이러스 상호 작용 연구) 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

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시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스