격자 광 시트 현미경 검사는 강력한 이미징 기술이지만, 세계에서 몇 실험실은 그것을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 시판되는 격자 광시트 현미경을 사용하는 방법에 대한 자세한 개요를 제공합니다. 그것은 분자의 실시간 추적을 허용하는 개별 적인 세포 또는 태아의 4 차원 화상 진찰의 가능하게 하는 매우 강력한 시스템입니다.
이 기술의 주요 장점은 높은 현시성 해상도와 최소한의 사진 표백을 가진 단일 라이브 세포 또는 장기를 입체적으로 이미지할 수 있다는 것입니다. 라이트 시트의 격자 패턴은 우리가 고속 이미지 샘플을 하고 다른 기술이 달성 할 수없는 분자 세부 사항과 3 차원 살아있는 세포와 장기의 실시간 비디오를 얻을 수 있습니다. 이 첫 번째 비디오 프로토콜은 단일 셀을 4차원으로 이미지화하기 위해 빛 시트 현미경 검사를 격자화하는 방법을 보여줍니다.
이것은 정렬 및 샘플 준비로 인해 매우 복잡한 기술입니다. 그리고 우리는 시각적 인 데모가 더 많은 과학자들이 생물학에서 많은 다른 분자, 세포 및 장기를 이미지 할 수 있도록함으로써 접근성을 향상시킬 것이라고 믿습니다. 이 절차를 시작하려면 실온에서 0.1% 폴리-L-리신으로 5mm 원형 커버립을 10분 동안 배양합니다.
액체를 흡입하고 커버립이 자연스럽게 건조하게 합니다. 다음으로, 15 밀리리터 원내 튜브에 밀도 그라데이션 3밀리리터를 추가합니다. 조심스럽게 튜브의 가장자리에 세포를 드롭 현명한 추가합니다.
원심분리기는 930g, 섭씨 4도에서 10분 간. 그 후, 전체 미디어와 밀도 그라데이션 시약 사이의 얇은 중간 층세포를 조심스럽게 제거하여 각 세포 유형을 별도의 원문 튜브에 넣도록 합니다. 세포를 세척하는 5 분 동안 300 배 g에서 원심 분리기.
상체를 버리고 T 세포및 CH27 세포의 튜브에 RPMI의 5 밀리리터를 추가합니다. 세 총 세척이 수행 될 때까지 신선한 RPMI로 세척을 반복합니다. 그런 다음, 완전한 RPMI의 1 밀리리터로 각 튜브의 세포를 다시 중단하고 혈종계로 세포를 계산합니다.
완전한 RPMI의 500 마이크로 리터에 백만 항원 제시 세포를 다시 중단하고 10 마이크로 몰러 MCC를 추가합니다. 37도에서 3시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그 후, 완전한 RPMI의 500 마이크로 리터에서 백만 개의 T 세포를 다시 중단합니다.
안티 TCR 베타 알렉사 488 라벨 의 마이크로 그램을 추가하고 30 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 배양. 다음으로, 두 세포를 300배 g에서 5분간 원심분리하고 상체부를 폐기한다. 완전한 RPMI의 500 마이크로리터를 추가하고 세포를 세척하는 원심분리기를 반복합니다.
세정제를 세척할 때마다 3회 세척이 수행될 때까지 신선한 RPMI로 세척을 반복합니다. 그 후, 이미징 미디어의 500 마이크로리터에서 두 세포 유형을 다시 중단합니다. 먼저 LLSM 욕조에 10밀리리터의 물과 30마이크로리터의 형광을 넣습니다.
이미지 홈을 눌러 물체를 이미지 위치로 이동하고 하나의 베셀 레이저 빔 패턴을 봅니다. 가이드와 관심 의 사전 설정 영역을 사용하여 레이저 빔을 정렬하여 빔을 모든 방향으로 균형잡힌 얇은 패턴으로 만듭니다. 빔도 파인더 카메라에 초점을 맞춘 것처럼 보입니다.
두 개의 미러 틸트 어저스터, 상단 초점 마이크로미터 및 목표 색상을 사용하여 빔을 조정합니다. 다음으로, 목욕과 목적을 최소 200 밀리리터의 물로 씻어 형광을 완전히 제거하십시오. 표준 형광 구슬을 이미지하려면 Xgalvo 레인지 박스에서 3개로 설정하여 디터를 켜고 Live를 눌러 현재 필드를 봅니다.
가장 높은 회색 값을 위해 기울기 거울, 목표 색상 및 초점 마이크로미터를 수동으로 조정합니다. 그런 다음 객관적인 스캔, Z 갈보, Z 플러스 목표 및 샘플 스캔 캡처 모드에 대한 적절한 패턴을 얻기 위해 필요에 따라 조정합니다. 그 후 샘플 스캔 모드에서 실행을 눌러 왜곡 해제 및 컨볼루션을 위한 샘플 포인트 스프레드 함수를 수집합니다.
레이저를 세 가지 색상 모드로 변경하고 실행을 다시 누릅니다. 시작하려면, 준비된 5밀리미터 직경 순환 커버슬립에 100, 000 안티 제시 세포를 추가하고 10 분 동안 정착 할 수 있도록. 샘플 홀더에 기름을 바르고 커버슬립을 셀 측에 위로 추가합니다.
다음으로, 커버슬립 의 뒷면에 이미징 미디어를 한 방울 추가합니다. 샘플 홀더를 피에조에 나사로 조이고 이미지 홈을 누릅니다. 이미지에 항원 제시 셀을 찾아 LLSM 및 이미징 소프트웨어가 제대로 작동하는지 확인합니다.
라이브를 눌러 현재 이미지를 봅니다. 덮개 슬립과 세포를 찾기 위해 Z를 따라 이동합니다. Z 방향으로 이동하여 항원 제시 세포의 중심을 찾은 다음 중지를 눌러 레이저를 일시 중지합니다.
3D를 확인하고 원하는 설정을 입력합니다. 센터를 누를 다음 실행을 눌러 데이터를 수집합니다. 스테이지를 하중 위치로 낮추고 50마이크로리터의 T-세포및 이미징 미디어를 커버슬립 위에 직접 드롭와이즈하게 추가합니다.
파이펫 팁 끝에 양식을 떨어뜨린 다음 팁을 목욕 액체에 만지는 것이 가장 좋습니다. 이미지 반환을 클릭하여 스테이지를 다시 올립니다. 이미징을 시작합니다.
원하는 Z 스택과 타임랩스 길이를 설정해야 합니다. 예를 들어 이미지 60 Z는 0.4 마이크로미터 스텝 크기와 입력 500 시간 프레임으로 스택됩니다. 사진 표백을 피하기 위해 500 프레임에 도달하기 전에 녹화를 중지합니다.
라이브 모드를 사용하여 셀 쌍을 검색하고 준비되고 원하는 설정이 입력되면 실행을 눌러 데이터를 수집합니다. 이 연구에서는, 1차 마우스 5CC7 T 세포는 단리되고 제조되고 격자 광시트 현미경을 사용하여 심화됩니다. 여기에 는 형광체로 이미지될 때 올바른 빔 경로와 빔 정렬이 표시됩니다.
목표 검사는 XZ 및 YZ 프로젝션에 가능한 한 대칭적인 큰 X 모양을 보여줘야 합니다. 또한 가능한 한 X의 작도록 조정해야 합니다. Z 갈보 스캔은 양쪽에 하나의 점이있는 XZ와 XY의 타원형을 보여줘야합니다.
마지막으로 Z 플러스 객관적인 스캔과 샘플 스캔 모두 가능한 한 둥글게 보이는 점을 보여줘야 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 T 세포 표면에 T 세포 수용체의 4 차원 역학을 볼 수 있었습니다. 이 현미경의 주요 장점은 T 세포 수용체의 시각화 된 표면 단위를 추적하고 크기, 운동, 신호 강도 및 배설물에서 정량화된 데이터를 얻는 능력에 있습니다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 정렬의 품질입니다. 격자 광시트는 매일 정렬되어야 하며 제대로 수행하지 않으면 왜곡된 이미징이 발생합니다. 마찬가지로 수집된 PSF의 품질은 컨볼루션의 품질에 직접적인 영향을 미치므로 궁극적으로 최종 이미지의 품질이 향상됩니다.
이 방법이 이렇게 강력한 이유 중 하나는 각 세포와 라벨을 대체하여 많은 세포 유형과 분자를 시각화할 수 있기 때문입니다. 따라서,이 방법은 분자의 4 차원 추적과 관련된 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 기술이 연구원이 분자 인신 매매 분야 내의 새로운 질문을 탐구하는 길을 열 것이라고 생각합니다.
복잡한 시스템으로 인해 아직 널리 사용되지 않으므로 이 Jove 비디오가 기술에 대한 접근성을 향상시킬 수 있기를 바랍니다. 시스템에 사용되는 레이저는 클래스 4이므로 레이저 안전을 보장하기 위해 절대주의를 기울여야합니다. 이 방법을 사용하기 전에 필요한 레이저 안전 교육을 받으십시오.
