Name: monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using χcrac
Uploaded: 2020-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
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이 연구는 Wellcome Trust(091549에서 SG로, 109093/Z/15/A에서 SM으로), Wellcome Trust Center for Cell Biology 핵심 보조금(092076) 및 Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship(MR/R008205/1 to SG), 장기 박사후 연구원(ALTF 1070-2017에서 RC)의 유럽 분자 생물학 기구(ALTF 1070-2017 to R.A.C)의 보조금으로 지원되었습니다. 덴마크 독립 연구 기금 (THJ).

A. Langford와 W. Worboys는 상업 회사인 UVO3에 소속되어 있습니다. 그들은 연구 설계, 데이터 수집 및 해석, 출판을 위해 작업을 제출하기로 한 결정에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

새로운 가교 및 세포 수확 장치와 결합된 χCRAC 방법은 광범위한 모델 유기체에 적용할 수 있고 따라서 RNA 분야에서 일반적으로 관심을 가져야 하기 때문에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. χCRAC를 활용할 수 있는 영역이 많이 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 종종 단백질과 RNA 분자 사이의 동적 상호작용을 포함하는 스플라이소좀 및 리보솜과 같은 큰 거대분자 복합체로 단백질의 계층적 조립을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 세포가 다양한 종류의 스트레스를 받을 때 RNA 붕괴 인자와 기질 사이의 상호 작용을 모니터링하는 데 일상적으로 사용합니다. 이를 통해 우리는 이러한 요인이 가장 활동적인 적응 반응의 단계, 결합하는 기질 및 이러한 상호 작용이 얼마나 역동적인지 결정할 수 있습니다. 이러한 데이터를 통해 연구자는 환경 변화에 적응하는 데 있어 각 요소의 상대적 기여도를 결정할 수 있어야 합니다.
χCRAC는 이중 친화성 정제 태그(HTF 또는 HTP)를 사용하여 매우 엄격하고 변성되는 조건에서 단백질을 정제합니다. 이는 관심 단백질에 공유 가교된 RNA에 대해 공동정제된 RNA가 고도로 농축되도록 합니다. 그러나 선호도 태그에 의존하는 것은 단점이 있습니다. 예를 들어, 태그는 단백질 기능을 방해하여 RNA 결합 상호 작용체의 왜곡된 판독값을 제공할 수 있습니다. 또한 일부 모델 유기체의 경우 DNA 단편을 게놈에 통합하거나 발현 플라스미드를 변형시키는 유전 도구가 아직 제공되지 않기 때문에 태그를 활용하는 것이 항상 가능하지 않을 수 있습니다. 그러나 RBP의 정제를 위해 항체에 의존하는 CLIP 기반 프로토콜과 호환되도록 χCRAC 프로토콜의 일부를 변경하는 것은 간단합니다. 실제로 이 연구는 iCLIP 기반 정제를 당사의 가교제와 결합하는 것이 가능하다는 것을 보여주었습니다. 우리는 현재 인간 RNA 결합 단백질과 초기 RNA 전사체의 시간적 연관성을 연구하기 위한 CLIP 프로토콜을 개발하는 과정에 있습니다.
새로운 단백질에 대해 χCRAC를 수행할 때 최대 가교를 유도하기 위해 UV 노출을 최적화해야 합니다. 이는 높은 UV 노출이 정제 단계에서 RNA의 회수율을 감소시킬 수 있기 때문에 중요합니다. 재조합 RBP를 발현하는 세포를 다양한 UV 용량, 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 및 1 J/cm2에 노출시켰다. 그런 다음 RNP를 포획하고 RNA를 단편화하고 방사성 표지했습니다. 그 후, RNP는 SDS-PAGE에 의해 해결되었고 어떤 노출이 가장 강렬한 신호(즉, 최대 가교)를 제공했는지 추론하기 위해 자가방사선사진을 촬영했습니다.
실험 조건이 최적화되면 χCRAC를 수행할 때 몇 가지 제어 실험이 권장됩니다. 먼저, UV 조사된, 태그되지 않은 샘플을 사용하여 정제 비드에 대한 백그라운드 결합을 모니터링할 수 있습니다. 둘째, 교대 실험 중에 χCRAC를 적용할 때 세포가 원래 배지로 다시 이동하는 두 번째 시계열은 세포 자체의 여과가 RNA 수준 또는 단백질-RNA 상호 작용의 변화를 유도하는지 여부를 조사할 수 있습니다.
서론에서 언급했듯이 최근에 발표된 수많은 논문은 CLIP 프로토콜에 대한 여러 가지 최적화를 제안합니다. 여기에는 적외선 스캐닝(10)을 통해 단백질-RNA 복합체를 검출하기 위한 형광 표지된 어댑터의 사용뿐만 아니라 결과 라이브러리(12,45)의 복잡성을 증가시키는 것으로 나타난 다양한 핵산 정제 및 크기 선택 단계에 대한 최적화가 포함됩니다. 우리는 현재 χCRAC 프로토콜을 더욱 구체화하기 위해 이러한 개선 사항 중 일부를 구현하고 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 데이터의 복잡성을 증가시키는 원래 CRAC 및 χCRAC 프로토콜에 대한 여러 개선 사항이 이미 포함되어 있습니다. 예를 들어, 이전에는 SDS-PAGE 겔 상에서 가교 결합 된 방사성 단백질 - RNA 복합체를 분해 한 후, 니트로 셀룰로오스 막으로 옮기고 가교 된 RNA를 블롯으로부터 분리시켰다. 그러나, RNP의 전달 및 후속 RNA 추출은 특히 RNA 중합효소 서브유닛과 같은 큰 RBP를 다룰 때 매우 비효율적일 수 있다. 이는 가교된 RNA의 회수율을 현저히 감소시킬 수 있다. 현재 프로토콜에서 가교된 RNA는 그림 1과 같이 SDS-PAGE 겔 슬라이스에서 직접 추출됩니다. 이것은 가교 된 RNA의 회수율을 증가 시켰습니다. 또한, cDNA의 PCR 증폭 후 생성물은 원래 3%, 저융점 온도의 아가로스 겔에서 분해된 다음 겔에서 175-300bp PCR 산물을 추출했습니다. 그러나 이러한 젤은 쉽게 과부하가 걸릴 수 있으므로 DNA가 매우 잘 분리되지 않습니다. 아가로스 겔을 프리캐스트 TBE 겔로 대체하면 보다 일관된 크기 분리와 PCR 산물의 더 나은 회수율이 나타났습니다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA는 종종 기능을 발휘하기 위해 RBP에 의존하기 때문에 이러한 분자 간의 역학을 이해하는 데 큰 관심을 갖게 되었습니다. 많은 RBP가 다양한 유기체에서 확인되었습니다. 그러나 생체 내에서 RBP-RNA 상호작용을 연구하는 것은 항상 어려운 것으로 악명이 높았습니다. 이러한 상호 작용을 연구하는 데 있어 중요한 돌파구는 CLIP1의 출현과 함께 이루어졌습니다. 이 방법은 자외선(UV, 254nm) 조사를 사용하여 RBP와 직접 결합된 RNA 사이의 공유 결합(즉, 제로 거리 가교)을 유도합니다. 이어서, 관심 있는 RBP는 단백질에 공유 가교된 RNA만 식별되도록 엄격한 조건 하에서 면역정제됩니다. 그런 다음 결합된 RNA는 RNase로 부분적으로 소화된 후 시퀀싱을 위해 cDNA 라이브러리로 변환됩니다. 높은 정제 엄격성은 단백질 및 RNA 회수의 특이성을 크게 증가시키기 때문에 중요하며, 이는 가교된 리보핵단백질(RNP) 복합체의 SDS-PAGE 정제를 통해 더욱 향상됩니다. CLIP 및 관련 방법은 또한 염기서열 분석 라이브러리를 준비하는 동안 RNA에 가교된 아미노산이 종종 역전사효소를 종결시키거나 효소가 이 부위에 돌연변이를 도입하도록 하기 때문에 단백질 결합 부위에 대한 뉴클레오티드 분해능 통찰력을 제공합니다 1,2,3.
도입 이후 오리지널 CLIP 프로토콜은 놀랍도록 다양한 파생 방법론을 만들어 냈습니다. 특히 중요한 돌파구는 고처리량 시퀀싱을 CLIP 접근 방식3과 병합하는 HITS-CLIP(또는 CLIP-seq)의 개발과 함께 이루어졌습니다. 이것은 이후 모든 CLIP 기반 방법론에서 채택되었습니다. iCLIP은 RBP 결합 부위의 보다 정확한 매핑을 용이하게 하는 RNase 매개 트리밍 및 어댑터 결찰 기술의 개선을 도입했습니다4. PAR-CLIP은 365 nm에서 가교결합과 함께 4thio-uridine / uracil 표지를 결합하여 T-C 치환을 분석하여 가교 부위를 매핑 할 수 있습니다5. CRAC, 요소-iCLIP, dCLIP 및 uvCLAP은 친화성 수지에 대한 배경 결합을 더욱 감소시키고 단백질 포획 2,6,7,8,9의 특이성을 더욱 증가시키는 변성 조건 및 이중 친화성 정제 단계를 도입했습니다. 또한 CRAC, uvCLAP 및 dCLIP은 관심 있는 RBP에 친화성 태그를 도입하여 특정 항체를 생성할 필요성을 극복했습니다.
CLIP 방법론을 촉진하기 위해 몇 가지 최적화가 이루어졌습니다. 원래의 CLIP 프로토콜은 SDS-PAGE 후 RBP-RNA 복합체를 시각화하기 위해 포획 된 RNA의 방사성 표지를 활용했습니다. 그러나 방사능의 사용은 그러한 작업을 위해 설정되지 않은 실험실에서 문제가 될 수 있습니다. irCLIP은 적외선 이미징(10 )을 통해 시각화를 용이하게 하는 형광단 결합 어댑터를 통합하고 sCLIP는 스트렙타비딘 결합 HRP(11)를 통해 시각화하기 위해 캡처된 RNA의 비오티닐화를 활용합니다. 또한 eCLIP은 RNA 라벨링을 완전히 포기합니다. 대신, 단백질은 알려진 크기12만을 기준으로 절제됩니다. 스트렙타비딘 기반 정제는 또한 FAST-iCLIP에서 라이브러리 준비 과정을 가속화하는 데 사용되어 왔으며, 여기서 비오티닐화된 3' 어댑터는 RNA에 연결되고 역전사 및 순환화 후 정제를 가능하게 하는 데 사용됩니다13. iCLIP 프로토콜에 대한 추가적인 개선은 또한 라이브러리의 복잡성을 크게 증가시켰다4.
마지막으로, CLIP는 상이한 세포 하위구획(14,15)으로부터 RBP를 포획할 수 있도록 수정되었고, 광활성가능한 리보뉴클레오시드(5,16,17)의 펄스 유도를 사용하여 새로 전사된 RNA를 시각화하고, 메틸화된 RNA를 포획(18,19,20), RNA-RNA 상호작용(21,22)을 조사하고, 3' 말단(23,24)을 매핑할 수 있도록 수정되었다.
RBP와 RNA 간의 상호 작용에 대한 이해를 돕는 데 CLIP 기반 기술이 크게 기여했음에도 불구하고 UV 가교의 비효율성으로 인해 제한되었습니다. 단층에서 성장한 배양 세포는 일반적으로 비교적 쉽게 가교할 수 있지만, 이는 조직 또는 용액 내 세포에서 훨씬 더 어렵습니다. 조직은 필요한 세포층에 침투하기 위해 여러 차례의 UV 노출이 필요할 수 있는 반면, 미생물 세포는 종종 방향족 자외선 흡수 화합물25을 포함하는 풍부한 배지에서 성장합니다. 실제로, 최대 30분의 UV 조사 시간은 이러한 샘플에 대해 RBP와 그의 결합된 RNA 사이에 충분한 가교결합을 생성하는 데 사용되었습니다(26,27,28). 이러한 연장된 UV 노출은 세포 내에서 스트레스 반응, 예를 들어 UV 유도 DNA 손상을 유도하며, 이는 일부 응용 분야에서 최종 데이터를 오염시킬 수 있습니다.
대부분의 CLIP 연구는 세포에서 특정 단백질-RNA 상호 작용의 단일 "스냅샷"을 생성하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 단백질-RNA 상호 작용은 특히 세포가 환경 변화에 노출될 때 본질적으로 역동적입니다. 여기에는 필수 영양소의 급격한 가용성 감소 또는 급격한 온도 변화가 포함될 수 있습니다. 따라서 스트레스 중 RBP의 역할을 진정으로 이해하려면 스트레스 동안 RBP 목표의 전체 스펙트럼을 캡처하고 선택한 RBP가 활성화되는 스트레스 반응 단계를 결정할 수 있기 때문에 시간 분해 분석을 수행하는 것이 가장 좋습니다. 특히, 효모에 대한 연구에 따르면 적응의 처음 몇 분은 생존에 절대적으로 중요하며 박테리아의 RNA 반감기는 몇 분에서 몇 초까지 다양할 수 있습니다 29,30,31,32,33. 따라서 이러한 시간 분해 분석은 이상적으로 높은 시간 분해능에서 수행되어야 합니다. 그러나 긴 가교 시간은 초기 단계 적응 반응에 대한 연구를 특히 어렵게 만듭니다.
이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 최근 분 길이의 시간 척도에서 세포를 가교 및 수확할 수 있는 개선된 방법을 개발했습니다. 당사의 χCRAC 방법을 사용하면 이전에 볼 수 없었던 분해능에서 RBP-RNA 상호 작용의 동적 변화를 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이 방법의 결정적인 것은 용액 내 효모와 박테리아에서 필요한 가교 시간을 약 10배 단축하여 RBP-RNA 상호작용을 순간적으로 효과적으로 동결시키는 새로운 UV 조사 장치(32 )의 개발이었습니다. 또한, UV 조사 후 세포를 빠르게 수확하기 위해 0.5L 배양액에서 기하급수적으로 성장하는 효모를 30초32일 내외로 수확할 수 있는 진공 여과 장치를 개발했습니다. 이러한 기술 혁신을 통해 미세 분해능에서 RBP-RNA 역학을 연구할 수 있습니다. 또한 실용성을 높이기 위해 원래 CRAC 프로토콜2 에 몇 가지 최적화를 도입했습니다.
χCRAC를 사용하여 우리는 최근 포도당 결핍에 대한 반응으로 효모 핵 RBP인 Nab3의 표적체를 연구했습니다. Saccharomyces cerevisiae에서 Nab3는 Nrd1, RBP 및 RNA 헬리카제 Sen1과 복합체를 형성하여 NNS 복합체를 형성할 수 있습니다. RNA 중합효소 및 초기 전사체에 결합하는 NNS는 전사 종결을 촉발할 수 있다34. 이 복합체는 주로 비밀스러운 비암호화 RNA 전사체를 제거하는 데 관여하지만 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 것으로도 나타났습니다. 이 연구는 단 1분의 스트레스 후에 Nab3를 비암호화 및 코딩 전사체로 차등적으로 표적화하는 것으로 나타났습니다32. 우리는 Nab3에 의한 공동 전사 종결이 기존의 CLIP 기반 접근 방식을 사용하여 검출하기 어려웠을 레트로트랜스포존 유전자의 매우 일시적인 펄스와 유사한 발현을 초래한다는 것을 입증했습니다. 또한, UV 가교제의 짧은 UV 조사 시간은 수명이 짧은 비암호화 RNA의 회수율을 크게 증가시켰습니다32. χCRAC는 RBP가 즉각적인 시간 척도에서 스트레스에 대한 대응을 형성하는 방법뿐만 아니라 응답의 전체 수명 주기 동안 변화하는 역할을 설명하는 데 중요한 도구가 될 것입니다. 이 원고는 χCRAC 프로토콜의 모든 단계에 대한 자세한 개요를 제공합니다. 예시적인 목적을 위해, 상기 방법은 전사 종결 및 RNA 붕괴에 관여하는 효모 Nrd1 단백질 및 다수의 시점에 걸쳐 글루코스 결핍에 반응하는 그의 RNA 표적체를 연구하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 우리는 또한 UV 조사 장치가 RBP를 HeLa 세포의 RNA에 빠르게 교차 연결하여 부착 세포에서 고분해능 시간 분해 분석을 수행할 수 있음을 입증합니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-dithioreitol</td><td>Merck</td><td>10708984001</td><td>Buffer component in mammalian cell lysis</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>General reaction tube</td></tr><tr><td>2 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td>For holding columns and collection of waste</td></tr><tr><td>32P-yATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG502Z-250</td><td>For radiolabelling the 5&#039; end of the RNA</td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>SDS-PAGE gel</td></tr><tr><td>4X loading buffer</td><td>Novex</td><td>NP0008</td><td>Protein loading dye concentrate</td></tr><tr><td>50 bp ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3236</td><td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td></tr><tr><td>50% PEG</td><td>NEB</td><td>B100045</td><td>For the L5 linker ligation</td></tr><tr><td>6% TBE gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6265BOX</td><td>For separation and purification of the cDNA library</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>ACROS Organics</td><td>423245000</td><td>Washing of TCA-precipitated proteins</td></tr><tr><td>anti-FLAG beads</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8823-1ML</td><td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0441</td><td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#039; end of captured RNAs</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td>Buffer component</td></tr><tr><td>Biomax MS intensifying screen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z363162-1EA</td><td>For intensifying the autoradiogram signal</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1010219</td><td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td></tr><tr><td>cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td></tr><tr><td>Complete supplement mixture -TRP</td><td>Formedium</td><td>DCS0149</td><td>For preparation of synthetic defined medium</td></tr><tr><td>Costar Spin-X 0.22 &amp;micro;m filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160</td><td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td></tr><tr><td>DNase RQ1</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>For DNA digest following cell lysis</td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4638956001</td><td>For reverse transcription and PCR</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10041814</td><td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>For protease K buffer</td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td>For degradation of primers following PCR</td></tr><tr><td>Glass microfiber filters</td><td>Whatman</td><td>1823-010</td><td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td></tr><tr><td>Glycogen (20 mg/mL)</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td></tr><tr><td>GST-TEV</td><td>Homemade</td><td></td><td>Construct and purification protocol is available upon request</td></tr><tr><td>Guanidium hydrochloroide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10071503</td><td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td></tr><tr><td>IgG beads</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>For purification of protein A-tagged RBPs</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td></tr><tr><td>Luna Universal One-Step RT-qPCR</td><td>NEB</td><td>E3005S</td><td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fluka Analytical</td><td>63020-1L</td><td>For PNK buffer</td></tr><tr><td>Membrane filters</td><td>Millipore</td><td>AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td><td>For vacuum filtration of cells</td></tr><tr><td>Micro bio-spin columns</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td>For collecting eluate after gel extraction</td></tr><tr><td>Ni-NTA beads</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>For secondary protein capture</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td>Buffer component</td></tr><tr><td>Pfu polymerase</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>For amplification of the cDNA library</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4682-400ML</td><td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td></tr><tr><td>Pierce spin columns</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69725</td><td>For on-column enzymatic reactions</td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Roche</td><td>3115887001</td><td>For degradation of the RBP following gel extraction</td></tr><tr><td>Quartz Petri dish</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td></tr><tr><td>Radiography films</td><td>Amersham</td><td>28906843</td><td>For autoradiography visualisation</td></tr><tr><td>RNAClean XP beads</td><td>Beckmann</td><td>A63987</td><td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297</td><td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td></tr><tr><td>RNase-It</td><td>Agilent</td><td>400720</td><td>For RNA digestion</td></tr><tr><td>rRNasin</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889-1KG</td><td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>Buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td>Buffer component in mammalian cell lysis</td></tr><tr><td>Sodium dodecylsulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-1KG</td><td>For protease K buffer</td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td></tr><tr><td>SuperScript IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>For reverse transcription</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>For radiolabelling the 5&#039; end of the RNA</td></tr><tr><td>T4 RNA ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#039; end</td></tr><tr><td>T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#039; end of captured RNAs</td></tr><tr><td>TBE buffer (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15581-028</td><td>For running TBE gels</td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Homemade</td><td></td><td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td></tr><tr><td>Thermosensitive alkaline phosphatase</td><td>Promega</td><td>M9910</td><td>For 5&#039; and 3&#039; dephosphorylation of RNAs</td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid (100%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699-100ML</td><td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td>Buffer component</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Buffer component in mammalian cell lysis</td></tr><tr><td>Vari Filter</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td></tr><tr><td>Vari-X-Linker</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td></tr><tr><td>Yeast nitrogen base</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td>For preparation of synthetic defined medium</td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Thistle</td><td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td><td>For cell lysis via bead beating</td></tr></tbody></table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

RNA 결합 단백질(RBP)과 RNA 기질 간의 상호 작용은 유동성과 복잡성을 나타냅니다. 수명 기간 동안 단일 RNA는 생산, 안정성, 활성 및 분해를 조절하는 다양한 RBP에 의해 결합될 수 있습니다. 따라서 이 두 유형의 분자 사이에 존재하는 역학을 이해하기 위해 많은 작업이 수행되었습니다. 특히 중요한 돌파구는 'cross-l inking and immunoprecipitation'(CLIP)의 출현과 함께 이루어졌습니다. 이 기술을 통해 어떤 RNA가 특정 RBP에 결합되어 있는지에 대한 엄격한 조사가 가능했습니다. 요컨대, 관심 단백질은 생체 내에서 RNA 기질에 UV 가교 결합되고 매우 엄격한 조건에서 정제된 다음 단백질에 공유 가교된 RNA를 cDNA 라이브러리로 변환하고 시퀀싱합니다. 개념 이후 CLIP을 특정 연구 분야에 적용 할 수 있도록 많은 파생 기술이 개발되었습니다. 그러나 자외선을 이용한 가교는 비효율적이기로 악명이 높습니다. 이로 인해 RBP-RNA 상호 작용에 대한 시간적 연구가 불가능해지는 노출 시간이 길어집니다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 최근에 훨씬 개선된 UV 조사 및 세포 수확 장치를 설계 및 구축했습니다. 이러한 새로운 도구를 사용하여 우리는 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포의 RBP-RNA 상호 작용에 대한 시간 분해 분석을 위한 프로토콜을 개발했습니다: Kinetic CRoss-linking 및 CDNA의 Analysis(χCRAC). 우리는 최근에 이 기술을 사용하여 영양소 스트레스 적응에서 효모 RBP의 역할을 연구했습니다. 이 원고는 χCRAC 방법에 대한 자세한 개요를 제공하고 Nrd1 RBP로 얻은 최근 결과를 제시합니다.

χCRAC 방법의 효능을 입증하기 위해, HTP-tagged Nrd1 단백질을 발현하는 효모 균주에 대한 시간 경과 실험을 수행하였다. 이 방법의 작동 방식을 설명하는 자세한 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. Nab3와 마찬가지로, Nrd1은 다양한 RNA 전사체의 핵 RNA 붕괴에 관여한다37. Corden 연구실의 이전 연구에서는 세포가 포도당 기아에 노출될 때 RNA 표적에 대한 Nrd1 결합이 크게 변한다고 제안했습니다28,38. 이와 같이, 포도당을 함유한 배지(SD-TRP)에서 기하급수적으로 성장하는 세포는 Nrd1-RNA 상호작용의 동적 변화를 모니터링하기 위해 시간 경과에 따라 포도당이 없는 동일한 배지(S-TRP)로 이동되었습니다. 샘플을 채취하여 Vari-X-linker 챔버(그림 3A)에서 교대 전과 1, 2, 4, 8, 14 및 20분 후에 가교했습니다. 세포 성장에 사용된 배지는 이 방향족 아미노산에 의한 UV 흡수를 감소시키기 위해 의도적으로 트립토판이 결핍되었습니다. 배지를 고압 증기 멸균하면 설탕이 캐러멜 화 될 수 있으므로 필터 멸균 된 합성 배지를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 그러면 가교 효율이 감소합니다.
도 4A 는 χCRAC 실험으로부터의 대표적인 자가방사선 사진을 나타낸다. 이 예제에서는 샘플이 함께 풀링되지 않았습니다. 대신에, 각각을 겔 상에서 개별적으로 실행하였다. 이것은 단백질이 테스트된 모든 시점에서 RNA에 효과적으로 가교된다는 것을 보여주기 위한 초기 실험 테스트에 권장됩니다. RBP의 예상 분자량에서 특히 강렬한 신호가 관찰되었는데, 이는 시퀀싱이 불가능한 매우 짧은 방사성 표지 RNA에 결합 된 단백질을 나타냅니다. 따라서, 더 긴 RNA 단편에 가교된 단백질인 이 밴드 위의 smeary signal이 분리되었습니다. 단편은 단백질 밴드 바로 위에서 약 30kDa를 더한 상태에서 절단되었습니다. 그림 4B 는 절제 후 자가방사선사진을 보여주며, 단백질은 겔에 남아 있는 짧은 RNA에 가교 결합되고 이전에 절제된 신호는 이제 절제되었습니다.
역전사 후 PCR을 사용하여 cDNA 라이브러리를 증폭해야 합니다. 그러나 라이브러리의 과증폭은 중합효소에 의해 우선적으로 증폭된 서열에 대한 편향을 도입하고 PCR 아티팩트를 생성할 수 있으므로 피해야 합니다. 과증폭된 라이브러리에는 시퀀서에서 읽기를 낭비하는 많은 수의 중복 시퀀스도 포함되어 있습니다. 최종 라이브러리의 증폭을 위한 이상적인 PCR 사이클 수를 계산하기 위해, cDNA의 분취량을 P5 및 BC 올리고뉴클레오티드를 사용하여 qPCR을 통해 증폭하였다. 라이브러리가 피크 형광에 도달한 첫 번째 주기가 PCR 주기 수로 선택되었습니다. 그림 4C 는 16의 피크 사이클 카운트를 산출한 일반적인 cDNA 라이브러리의 qPCR의 예를 제공합니다. 이어서, 이 값을 최종 χCRAC PCR에 사용하였다. 시퀀싱된 데이터를 처리하기 위해 실험실에서 이전에 개발한 소프트웨어(pyCRAC)와 키네틱 CRAC 데이터 분석을 위한 해당 파이프라인을 사용했습니다(Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). 이러한 오픈 소스 소프트웨어 툴은 데이터의 역다중화 및 트리밍, PCR 중복의 제거, 통계적으로 유의한 피크의 식별, 연속적인 서열로의 클러스터 판독 및 결합 모티프의 식별을 가능하게 한다(39). 이러한 도구의 작동 방식에 대한 자세한 내용은 해당 웹 페이지에서 확인할 수 있습니다.
우리는 또한 포유류 세포에 대한 χCRAC 프로토콜을 개발하기 시작했습니다. 대부분의 포유류 세포주는 단층으로 성장하며 UV 투과성 백이 있는 가교제의 트레이는 부착 세포 실험에 적합하지 않습니다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 사용자가 부착 세포로 1-2개의 페트리 접시(직경 150mm, 깊이 25mm)에 UV를 조사할 수 있는 단계를 개발했습니다(그림 3B). 첫 번째 테스트로서, 포유류 세포에 대한 가교제의 효율은 항-GFP 항체 및 전통적인 CLIP 기반 정제를 사용하여 안정적으로 태그된 GFP-RBM7의 가교 및 포획을 통해 측정되었습니다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, 가교제는 널리 사용되는 UV 조사 장치에 필적하는 효율로 254nm UV 조사를 사용하여 단층으로 성장한 포유동물 세포로부터 단백질-RNA 복합체를 회수할 수 있었다. 그러나 UV 가교 실험에 일반적으로 사용되는 표준 세포 배양 플라스틱웨어는 254nm UV까지 침투할 수 없습니다. 따라서 우리의 가교제에서 세포는 UV 램프의 상부 뱅크에서만 조사를받습니다. 이를 극복하기 위해 우리는 세포 성장과 가교를 위한 UV 투과성 석영 페트리 접시를 개발했습니다. 석영 배양기구를 사용하면 2초의 UV 조사만으로 단백질-RNA 복합체의 강력한 회수율이 나타났습니다(그림 5B). CLIP 기술과 같은 포유류 세포에 대한 RBP 포획 방법과 결합할 때, 이러한 짧은 가교 시간은 유전독성 스트레스 또는 단백질 인자의 급격한 고갈에 대한 반응으로 RBP의 시공간 RNA 결합 프로파일을 회복하기 위한 시간 경과에 따라 또는 전사 또는 세포 주기 동기화와 병행하여 사용할 수 있습니다.
그림 6 은 χCRAC 파이프라인에 의해 처리되는 Nrd1 데이터의 몇 가지 예를 보여줍니다. 이 그림은 파이프라인에서 생성된 베드그래프 파일과 python GenomeBrowser 패키지(https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/)를 사용하여 준비되었으며, 데이터의 출판 품질 게놈 브라우저 이미지를 간단하게 만들 수 있도록 설계되었습니다. 회색 직사각형은 CUT(cryptic unstable transcript), SUT(stable uncharacterized transcript)40 및 Xrn1 민감성 불안정 전사체(XUT)41와 같은 비암호화 RNA를 발현하는 게놈 영역을 나타냅니다. 도 6 의 데이터는 Nrd1이 이들 비암호화 RNA 전사체의 다수에 결합한다는 것을 보여주며, 이는 이 단백질이 이 부류의 전사체의 분해에 관여한다는 생각과 일치한다42. 그림 6A 는 염색체 IV의 ~15kb 영역을 보여줍니다. 여기에서 고친화성 글루코스 수송체 HXT6 및 HXT7을 코딩하는 전사체에 대한 Nrd1의 결합이 유의하게 증가되었으며, 둘 다 글루코스 기아 동안 상향조절됩니다. NNS 복합체에 의한 전사 종결은 포도당 기아 동안 이들 유전자의 유도 동역학에 영향을 미칠 수 있습니다. 도 6B 는 Nab3에 의해 조절되는 것으로 알려져 있는 Imd3 전사체에 대한 Nrd1 가교결합의 예를 나타낸다(43). 이 경우 데이터는 포도당 기아에 대한 결합의 현저한 감소를 보여주었습니다. 이전 연구는 포도당 기아 동안 Tye3 전사체에 대한 Nab7의 결합이 감소한 것으로 나타났습니다44. 이러한 관찰과 일관되게, χCRAC 데이터는 Nrd1의 결합이 포도당 결핍 동안 감소하고 Tye7에 대한 Nrd1 가교결합이 스트레스 8분 후에 가장 낮았다는 것을 시사한다(그림 4C). 그러나 이 효과는 14분의 포도당 결핍 후 Nrd1 결합이 시작 수준으로 돌아갔기 때문에 일시적인 것으로 보입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> 그림 1 : χCRAC 프로토콜의 개략도. 태그된 균주는 원하는 밀도가 될 때까지 성장시켰다. RBP는 RNA 결합 단백질을 나타냅니다. 그 후, 기준 샘플을 채취하여 254nm UV 광으로 가교시켰습니다. 나머지 세포는 여과에 의해 수확된 후 스트레스 유도 배지로 빠르게 이동되었습니다. 여기에 설명된 χCRAC 실험을 위해 샘플을 채취하여 교대 후 1, 2, 4, 8, 14 및 20분에 가교했습니다(1). 그런 다음 매우 엄격한 2단계 친화성 정제(2)를 사용하여 관심 RBP를 정제했습니다. 다음으로, 포획된 가교 결합된 RNA를 RNase로 부분적으로 소화하고, 5' 말단에서 방사성 표지하고, 어댑터를 그 위에 라이게이션했습니다(3). 5' 어댑터에는 고유한 "판독 중" 바코드 시퀀스가 포함되어 있어 시퀀싱 후 개별 샘플을 생물정보학적으로 분리할 수 있습니다. 그런 다음 RBP-RNA 복합체를 함께 용리, 풀링 및 침전시키고(4), SDS-PAGE로 분해하고, 자가방사선 촬영을 통해 시각화했습니다(5). 이어서, 자가방사선 촬영 이미지에서 빨간색 점선 상자로 표시된 주 대역 바로 위의 방사성 신호를 포함하는 단일 겔 슬라이스를 겔(5)에서 절단했습니다. 겔 슬라이스를 프로테아제 K로 처리하고 RNA를 연속적으로 추출하고(6), cDNA로 전환하고, PCR을 통해 증폭했습니다(7). PCR 단계에서는 추가 바코드(P7 oligo에 의해 도입된 노란색 블록)를 도입하여 많은 라이브러리를 단일 레인으로 다중화할 수 있었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> 그림 2: 가교 및 진공 여과. (a) 가교제. 세포 현탁액을 기계의 오른쪽 상단에 위치한 깔때기에 붓고(클로즈업은 그림 3A 참조) 중간 트레이에 있는 UV 투명 백에 보관합니다. 이 가방 옆에는 사용자가 조사 단계를 시작하도록 기계에 지시할 때까지 닫힌 상태로 유지되는 두 개의 셔터가 있습니다. 세포는 위와 아래 트레이에서 UV 광선을 조사합니다. 이 기계에는 254 및 365 nm UV 램프가 제공되며 후자는 PAR-CLIP 실험에 적용 할 수 있습니다. 기계는 오른쪽 상단에 있는 터치스크린 패널을 통해 작동되어 UV 복용량 또는 노출 시간을 제어할 수 있습니다. (B) 가교 후 셀은 기계의 왼쪽에서 배출됩니다. 세포 현탁액은 진공을 통해 회수되고 유리 플라스크로 배출되어 수확을 위해 진공 여과 장치에 부어 질 수 있습니다. (C) 진공 여과 장치. 이들은 클립을 통해 열리고 닫히며 그 사이에 필터가 삽입됩니다. 필터 교체로 인한 시간 손실이 없도록 매우 짧은 시계열 동안 4개의 여과 장치를 병렬로 사용했습니다. (D) 여과 후, 배지 상청액을 후속 폐기를 위해 플라스크 내로 배출하였다. 밸브는 필터가 제거될 때 시스템의 진공을 유지하기 위해 진공 여과 장치 아래에 설치되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> 그림 3: 부유 세포와 부착 세포의 교차 결합. (a) 현탁 세포용 Vari-X-linker 챔버를 갖는 가교제. 세포 배양액을 트레이의 오른쪽 상단에 있는 샘플 주입구(깔때기)에 붓습니다. (B) 부착 세포 또는 소량의 현탁 세포를 가교하기 위한 플라스틱 또는 석영 페트리 접시를 담을 수 있는 트레이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> 그림 4: 라이브러리 준비. (A) Nrd1-HTP χCRAC 실험의 자가방사선사진의 예. 강하고 농축된 신호는 매우 짧은 RNA에 가교된 단백질을 나타내는 반면, 위의 스미어는 시퀀싱에 충분한 길이의 RNA에 가교된 단백질을 나타냅니다. (B) 도말은 겔 절제 후 촬영한 자가방사선사진에 표시된 대로 절제되었습니다. (C) χCRAC cDNA 라이브러리의 대표적인 qPCR. 이 예에서, cDNA의 최대 증폭은 16 사이클에서 도달하였다. 따라서, 최종 증폭을 위해 16 사이클이 사용되었다. 오차 막대는 세 가지 기술 qPCR 반복실험의 표준 편차를 나타냅니다. (D) 6% TBE 겔 상의 cDNA 라이브러리로부터의 인광상의 예. (e) 칩 기반 모세관 전기영동으로부터의 cDNA 길이 및 품질 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> 그림 5: 포유류 세포에서 가교를 테스트하기 위한 High RNase 테스트 iCLIP 실험. GFP-RBM7 iCLIP 실험의 자가방사선 사진은 다양한 가교 에너지에 걸쳐 RNP 회수 효율을 테스트한 것입니다. GFP-RBM7을 안정적으로 발현하는 가교 세포의 자성 비드에 결합된 항-GFP 항체를 사용하여 면역침전을 수행했습니다. 면역침전물은 관련 RNA를 짧고 균일한 길이로 트리밍하기 위해 고농도의 RNase I과 함께 배양되었습니다. RNP는 32P표지 및 SDS-PAGE에 의해 시각화되었고, 가교되지 않은 단백질의 이동에 가까운 정의된 밴드로 이동하였다. 정량화는 항 GFP 웨스턴 블롯 신호로 표준화 된 방사성 표지 된 RBM7-RNA 신호의 밀도 측정 분석 결과를 나타낸다. (a) 일반적으로 사용되는 UVP 가교제 대 당사의 가교제의 가교 시간 경과(Vari-X-linker; (B) 석영(왼쪽)과 플라스틱(오른쪽) 배양 기구에 대한 가교제의 가교 시간 경과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> 그림 6: 표적에 대한 Nrd1의 차등적, 시간적 결합을 보여주는 χCRAC의 힘을 보여주는 게놈 브라우저 플롯의 예. 각 상자에는 개별 게놈 영역에 대한 플롯이 표시됩니다. 화살표는 유전자가 인코딩되는 가닥을 나타냅니다(왼쪽 가리킴 화살표 = 마이너스 가닥, 오른쪽 가리킴 화살표 = 더하기 가닥). 시점(min)은 각 서브플롯의 y축에 t0, t1, t2 등으로 표시됩니다. 염색체와 좌표를 나타내는 로마 숫자가 표시됩니다. (A) 포도당 결핍 시, Nrd1은 두 개의 고친화성 포도당 수송체인 HXT6 및 HXT7에 결합하며, 둘 다 이 상태에서 상향 조절됩니다. (B) Nrd1은 이미 검증된 Nab344의 표적인 Imd3에 결합하는 것으로 관찰되며, 포도당 결핍 후 강도가 감소합니다. (C) Tye7의 Nrd1 결합은 역동적이고 일시적인 성질을 나타내며, 포도당 결핍 후 8 분의 스트레스 후 최소로 감소한다. 그러나 결합은 이후 14분 후에 기저 수준으로 돌아갑니다. 읽기는 "백만당 읽기 수"(RPM; y축)로 정규화되었습니다. 회색 상자는 비암호화 RNA를 인코딩하는 영역을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.9K 조회수.  University of Edinburgh. cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

비디오: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

유전학

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

생물학

Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor

In-cell NMR is a unique approach to observe the structural and dynamic properties of biological macromolecules at atomic resolution directly in living cells. Protein folding, chemical modifications, and conformational changes induced by ligand binding can be observed. Therefore, this method has great potential in the context of drug development. However, the short lifetime of human cells confined in the NMR spectrometer limits the application range of in-cell NMR. To overcome this issue, NMR bioreactors are employed that can greatly improve the cell sample stability over time and, importantly, enable the real-time recording of in-cell NMR spectra. In this way, the evolution of processes such as ligand penetration and binding to the intracellular protein target can be monitored in real time. Bioreactors are often limited by low cell viability at high cell numbers, which results in a trade-off between the overall sensitivity of the experiment and cell viability. We recently reported an NMR bioreactor that maintains a high number of human cells metabolically active for extended periods of time, up to 72 h. This setup was applied to monitor protein-ligand interactions and protein chemical modification. We also introduced a workflow for quantitative analysis of the real-time NMR data, based on multivariate curve resolution. The method provides concentration profiles of the chemical species present in the cells as a function of time, which can be further analyzed to obtain relevant kinetic parameters. Here we provide a detailed description of the NMR bioreactor setup and its application to monitoring protein-ligand interactions in human cells.

This protocol describes the setup of an NMR bioreactor to keep encapsulated human cells viable for up to 72 h, followed by time-resolved in-cell NMR data acquisition and analysis. The methodology is applied to monitor intracellular protein-ligand interactions in real time.

고세포 밀도 생물반응기를 이용한 실시간 정량적 세포내 NMR에 의한 인간 세포에서의 단백질-리간드 상호작용 모니터링

In-cell NMR is a unique approach to observe the structural and dynamic properties of biological macromolecules at atomic resolution directly in living ...

화학

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...