세포 미세소관 어레이는 기능에 필요한 뚜렷한 동적 특성을 갖는 미세소관의 하위집단을 포함한다. 이 프로토콜은 규제 기관의 집단 활동이 뚜렷한 특성을 가진 근위 미세 소관 하위 집단을 부여하는 방법을 다룹니다. 이 상향식 회복 분석을 통해 우리는 단일 미세 소관 및 번들과 같은 근위 미세 소관 집단의 조직과 역학을 동시에 시각화하고 자체 조직의 기초가되는 메커니즘을 해독 할 수 있습니다.
다성분 재구성을 위해서는 pH, 이온 강도 및 단백질 농도와 같은 실험 파라미터를 최적화하면서 각각의 활성을 보존해야 합니다. 다중 단백질 분석 전에 개별 성분을 체계적으로 분석하는 것은 매우 유용합니다. 시작하기 위해, 4.5 마이크로리터의 BRB ADDTT를 하나의 마이크로리터의 미세소관 용액에 혼합한 것을 현미경 슬라이드 상에 피펫팅한다.
18 x 18mm 커버슬립으로 덮고 투명한 매니큐어 또는 VALAP 실란트로 가장자리를 밀봉합니다. TIRF 목표를 커버슬립 아래에 놓습니다. 밝은 믹스에서 형광 표지된 튜불린에 적합한 파장에서 새로 중합된 미세소관을 시각화하여 다가오는 실험에 사용할 미세소관의 희석액을 결정한다.
모든 형광 단백질이 조명되도록 실험에 대한 레이저 강도를 경험적으로 결정하되 실험의 시간 과정에 걸쳐 상당한 광표백을 겪지 않는다. 현미경 온도를 섭씨 28도로 설정하여 동적 미세 소관을 볼 수 있습니다. 렌즈 용지를 사용하여 70 % 에탄올로 100X 대물렌즈를 청소하십시오.
이미징할 형광 채널에 따라 필터 큐브와 방출 필터의 최상의 조합을 사용하십시오. 이미징 시퀀스를 설정합니다. 647 나노미터 형광단-표지된 비오티닐화 마이크로세뇨관, 560 나노미터 형광단-표지된 비-가용성 튜불린, 및 GFP 표지된 관심있는 단백질에 대한 실험을 위해, 20분 동안 매 10초마다 488 나노미터, 560 나노미터 및 647 나노미터 채널을 이미지화하였다.
가용성 튜불린 및 미세소관 관련 단백질을 첨가하기 전에 번들의 참조 이미지를 캡처하려면 560 나노미터 및 647 나노미터 파장 채널에서 각각 하나의 이미지로 시퀀스를 설정하십시오. 현미경 위의 천장에있는 레이저 빔의 위치를 확인하고 소프트웨어를 사용하여 빔을 변경하십시오. 레이저 조명기가 정렬되어 있는지 확인하십시오.
이미징하기 전에 현미경 침지 오일 한 방울을 목표에 추가하십시오. 가용성 튜불린 혼합물을 얼음 위에 보관하면서 준비하고 혼합물을 회전시킵니다. 비오틴-NeutrAvidin-비오틴 결합을 통해 미세소관을 고정화시키기 위해, 먼저 챔버가 채워질 때까지 약 7.5 마이크로리터의 NeutrAvidin 용액으로 유동시키고 5분 동안 인큐베이션한다.
10 마이크로 리터의 MB 감기로 씻으십시오. 블로킹 단백질 KC의 7.5 마이크로리터를 유동시키고 2분 동안 인큐베이션한다. 10 마이크로리터의 MB를 따뜻하게 세척하여 미세소관의 도입을 위한 챔버를 준비한다.
BRB ADDTT에서 비오티닐화 된 미세 소관의 스톡을 희석하고이 희석액의 한 마이크로 리터를 MB 따뜻한 아홉 마이크로 리터에 첨가하십시오. 혼합물을 챔버 내로 유동시키고 10분 동안 인큐베이션한다. 고정되지 않은 미세 소관을 10 마이크로 리터의 따뜻한 상태로 씻어 내십시오.
7.5 마이크로리터의 따뜻한 KC를 챔버 내로 유동시키고 두 분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, KC에서 가교결합 또는 단백질 PRC1의 두 나노몰 용액을 제조하고 용액을 스핀다운한다. 이 용액 10 마이크로리터를 이미징 챔버 내로 유동시키고 5분 동안 인큐베이션한다.
번들을 만들기 위해, 10 마이크로리터의 비오티닐화 미세소관을 챔버 내로 흘려보내고 10분 동안 인큐베이션한다. 10 마이크로 리터의 MB로 챔버를 두 번 씻으십시오. 10분 인큐베이션 시간 동안, 관심있는 단백질, 가용성 튜불린, 뉴클레오티드, 산소 제거제, 및 항산화제를 함유하는 10 마이크로리터의 분석 혼합물을 준비하고 그것을 스핀다운시킨다.
혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 준비된 이미징 챔버를 100X TIRF 목표의 슬라이드 홀더에 로드합니다. 560 나노미터 및 647 나노미터 채널을 사용하여 단일 마이크로소관 및 번들의 최적 수와 밀도를 포함하는 시야를 찾으십시오.
시야각이 식별되면 참조 이미지를 가져옵니다. 이미징 챔버를 방해하지 않고 분석 혼합물을 조심스럽게 유동시킨다. 챔버의 열린 끝을 VALAP 실란트로 밀봉하십시오.
미세 소관을 관찰하고 이미징 시퀀스를 시작하십시오. 미세소관 종자를 고정화하고 다발을 생성한 후, 형광 이미지를 수득하였다. 단일 미세소관은 647 나노미터 채널에서 형광 신호로 확인된 반면, 미세소관은 두 채널 모두에서 형광 신호를 표시할 때 미리 형성된 다발로 확인되었습니다.
단일 미세소관 및 PRC1 가교결합된 다발의 역학은 단백질 KIF4A 및 CLASP1의 존재하에 연구되었으며, 이는 단일 미세소관이 분석 과정에 걸쳐 길어지는 반면, 가교결합된 미세소관의 성장은 지연된다는 것을 밝혀냈다. 중합 된 미세 소관을 실온 이상으로 유지하도록주의하십시오. 가용성 튜불린을 얼음 위에 보관하고 이미징 챔버와 형광 표지 된 미세 소관 및 단백질을 빛으로부터 보호하십시오.
이러한 분석은 유사분열 스핀들에서 발견되는 단백질 모듈이 스핀들에 공존하는 두 개의 서로 다른 미세소관 집단의 역학을 어떻게 차별적으로 조절할 수 있는지에 대한 기계론적 통찰력을 제공했다.
