이 방법을 통해 사용자는 간 발달, 재생 및 만성 질환에 대한 연구를 위해 2D 조직 섹션에서 간세포 핵 DNA 함량의 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이 자동화 된 높은 처리량 접근법은 모든 2D 간 조직 섹션에 적용 될 수 있으며, 모든 간단한 원형 간세포 핵에 대한 핵 계략의 내부적으로 보정 된 판독을 제공합니다. 간세포 핵 계포의 변화는 노화, 만성 간 질환 및 암과 관련이 있습니다.
이 기술은 고정 또는 냉동 보존 간 표본에서 핵 계략을 프로파일하는 간단한 수단을 제공합니다. situ ploidy 프로파일링 방법은 조직 분리 또는 신선한 물질에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 간 질환 진행을 추적하기위한 연구 및 임상 도구로 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 뮤린 간 조직 샘플을 수확 한 후, 최적의 절단 온도 매체에 간 소구를 포함 하 고 즉시 빠른 동결을 보장 하기 위해 건조 얼음에 금형을 배치.
냉동 간 소굴 샘플의 조각을 얻으려면 샘플을 6 마이크로미터 두께로 섹션화하여 각 샘플에 5초 동안 폴리아미드 코팅 슬라이드를 배치하여 각 샘플이 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 모든 슬라이스를 채취하면 면역 라벨링 전에 실온에서 3~5분 동안 샘플을 평형화할 수 있습니다. 평형의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리리터와 연기 후드에 조직 섹션을 수정합니다.
고정이 끝나면 부드러운 동요로 PBS에서 3분 동안 세 번 의 세차처리로 슬라이드를 헹구십시오. 마지막 세척 후 각 조직 섹션 주변을 건조시키고 소수성 펜을 사용하여 각 샘플 주위에 원을 그립니다. 시료를 투과화하려면 PBS에서 0.5% 비이온 계면활성제로 실온에서 15분 동안 섹션을 처리합니다.
인큐베이션이 끝나면 PBS에서 3분 동안 시료를 부드러운 교반으로 2회 세척한 후 1%소 세럼 알부민, 5%말 세럼, 0.2%의 비이온 계면활성제를 실내 온도에서 최소 1시간 동안 여과된 용액으로 차단합니다. 다음으로, 빛으로부터 보호되는 습한 염색실에서 밤새 섭씨 4도에서 버퍼를 차단하는 데 희석된 HHF4-알파 항체로 슬라이드를 배양한다. 다음날 아침, 적절한 형광컨이차항체와 Hoechst가 1%의 소세럼 알부머와 0.2%의 비이온 계면활성제로 희석되어 적절한 형광을 결합하여 PBS에서 부드러운 교반으로 PBS에서 4회 세척하여 빛으로부터 보호되는 습한 얼룩챔버의 실온에서 2시간 동안 PBS에서 희석된다.
인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 시연한 대로 4번 세척한 다음, 부드러운 교반으로 이중 증류수로 23분간 세척합니다. 마지막 세척 후, 커버슬립에 형광 장착 배지 2방울로 샘플을 장착하고 거품을 제거하기 위해 필요에 따라 부드러운 압력을 가합니다. 그런 다음, 좋은 고정 및 면역 라벨링을 보장하기 위해 기존의 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인합니다.
형광 이미지 수집의 경우, 사용되는 형광에 대한 적절한 흥분을 사용하여 형광 이미지를 획득하기 위해 고함량 이미징 플랫폼에 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 샘플을 스캔하여 충분한 이미지를 획득하여 조직 섹션의 완전한 커버리지를 얻습니다. 스캔의 끝에서, 핵이 최적으로 분리되도록 소프트웨어의 핵 분할 매개변수를 조정하고 HNF4 알파 양성 간세포 및 HNF4-알파 음의 비 parenchymal 세포의 최적의 게이팅을 보장하기 위해 임계 값 강도를 수정한다.
핵 정량화를 위해, 원자력 영역을 호흐트스트 염색, 주요 핵 호흐트 스트론, 핵 신장 계수, 평균 핵 원반 지수, HNF4 알파 상태 및 핵 X, Y 좌표를 기반으로 한 정사각형 마이크로미터로 설정합니다. 간세포 핵 계수 분석을 수행하기 위해 먼저 플로이디 정량화 분석 프로그램을 다운로드하고 설치합니다. MATLAB에서 도구 스트립의 앱 탭으로 이동하여 앱 설치를 클릭합니다.
Ploidy 응용 프로그램 ML 응용 프로그램 설치 프로그램을 엽니 다. 성공적인 설치를 확인하는 메시지가 나타납니다. 각 데이터 분석 파일에는 표시된 대로 열에 설정된 ploidy 분석에 필요한 모든 데이터를 포함하는 셀 측정이라는 시트가 포함됩니다.
각 실험 조건에 대해, 2~4개의 N 핵 교정에 대한 내부 제어를 계산하는 데 사용되는 제어 데이터 집합을 제공합니다. 생물학적 복제의 경우 각 스프레드시트를 자체 폴더에 저장하여 폴더 접두사 이름을 점진적으로 지정합니다. 다음으로, Ploidy 응용 프로그램을 시작합니다.
Ploidy 응용 프로그램 그래픽 사용자 인터페이스가 나타납니다. 제어 데이터가 복제되는 폴더로 이동하려면 데이터 제어 경로 단추를 클릭합니다. 그런 다음 이 데이터 경로가 인터페이스에 나타납니다.
폴더 접두사에서 출력 파일에 부여할 이름을 입력합니다. 다른 데이터로 가는 경로 단추를 클릭하고 비교 데이터가 복제되는 폴더로 이동합니다. 그런 다음 이 데이터 경로가 인터페이스에 나타납니다.
그런 다음 실행을 클릭합니다. 분석이 완료되면 상태 표시줄에서 분석 완료를 읽습니다. 면역 라벨링 후, 종래의 형광 현미경 검사법에 의한 모든 슬라이드를 검사하여 양질의 고정 및 염색이 수득되었는지 확인하는 것이 중요하다.
Hoechst 염료의 번짐 또는 흐림은 고정 전에 부적절한 고정 또는 시료 분해를 나타낼 수 있습니다. 핵 분리 및 HNF4-알파 임계값 파라미터는 형광 현미경 검사법에 의해 관찰된 면역염색의 시각적 패턴을 광범위하게 반영하기 위해 자동 이미지 분석 전에 신중하게 최적화되어야 한다. 이미지 분석에 따라, 데이터는 DDC 상해를 가진 간 내의 HNF4 알파 양성 핵 수의 비 parenchymal 세포 및 작지만 중요한, 감소의 증가를 반영해야 합니다.
건강한 대조군 간에서는 HNF4-알파 양성 핵의 약 63%가 간단한 원형 morphometry를 나타낸다. 대조군과 DDC 처리군 간의 상대적인 핵계포이를 비교하면 8C 세포보다 많은 수와 함께 부상을 입은 2C 및 4C 간세포 핵의 현저한 손실을 반영해야 한다. 각 계피 하위 그룹에 대한 상대적 위치 정보는 고함량 이미지 분석 소프트웨어 내에서 특정 간세포 하위 집합의 2D 위치를 검색하여 심문될 수 있다.
Ki-67과 같은 추가 항체를 가진 면역 라벨링은 세포 복제및 간세포 핵 morphometry 데이터를 평가하기 위해 수행될 수 있으며, 이는 ploidy 분석을 칭찬하기 위해 더 심문될 수 있다. 이 방법에 의해 생성된 조직 전체 계피 프로파일은 모든 원형 간세포 핵에 대한 최소 DNA 함량을 설명하지만 단핵 세포와 이중 핵 간세포 를 구별하지는 않습니다. 이 방법은 잠재적으로 세포 둘레와 같은 매개 변수를 고려하여, 이중 핵 세포의 식별을 용이하게 하고 세포 계략의 추가 판독을 제공하기 위하여 적응될 수 있습니다.
