이 방법은 디설파이드 풍부한 펩티드를 합성하고 해당 이황화물 교량 패턴을 결정하는 것과 같은 펩티드 합성 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 상이한 이황화물 본드 엔드 펩타이드 이소머스와 후속 화학 및 구조적 특성의 선택적 합성을 허용한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 새로운 개인 각 이황파이드 풍부한 펩티드는 다르게 행동하기 때문에 투쟁할 것입니다.
합성 및 분석은 개별 펩타이드 또는 단백질에 부분적으로 최적화되어야 할 수도 있다. 텍스트 프로토콜에 나열된 시약을 해당 용기로 옮기고 고체 위상 펩타이드 신디사이저의 적절한 라켓에 배치한다. 그런 다음 반응 컬럼에 100 밀리그램의 마른 수지를 추가하고 신디사이저의 라켓에 넣습니다.
텍스트 프로토콜에 상세한 대로 고형 펩티드 합성을 시작합니다. 합성이 완료된 후, 하룻밤 동안 수지를 lyophilized. 이제 수지에서 펩티드를 갈라서 측면 사슬의 깊은 보호를 수행합니다.
이렇게하려면 12 밀리 리터 튜브에 말린 수지와 얼음에 섭씨 0도로 냉각합니다. 먼저, 150 마이크로리터를 스캐빈저 혼합물을 추가한 다음 수지 100밀리그램당 95%의 트리플루오로아세트산 1밀리리터를 추가합니다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어 둡니다.
이제 유리 프릿을 통해 혼합물을 필터링합니다. 디틸 에테르 8~10밀리리터당 골짜기 혼합물 1밀리리터에서 얼음-차가운 디틸 에테르로 개별적으로 채워진 튜브의 여과물을 수집합니다. 펩타이드는 백색 고체로서 침전됩니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 튜브를 헹구고 원심분리한 후 펩티드를 동결건조시한다. 반 전구체를 반 전구체로 정화하기 위해 15 밀리리터 튜브에 약 70 밀리그램의 조펩티드를 첨가한다. 그런 다음 원유 펩티드를 0.1%TFA및 일대일 아세토닐릴로 용해하여 물에 녹입니다.
분당 10 밀리리터의 유량으로 120분 이상 0~50%의 Eluent B의 그라데이션을 사용하여 펩티드 혼합물을 분리한다. 개별 튜브의 분획을 수집하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 질량 분광및 HPLC 분석을 위해 선택한 분획을 준비합니다. 분획을 동결건조하고 피어 분획을 결합합니다.
첫 번째 산화를 수행하여 이황화물 결합의 선택적 형성을 시작합니다. 이렇게하려면 동결 건조 선형 펩타이드 15 밀리그램을 이소프로판올 물 혼합물의 105 밀리리터에 녹입니다. 12~48시간 동안 기본 조건하에서 혼합물을 공기 에 둡니다.
단계별 산화 절차는 매우 중요합니다. 반응 제어는 개별 이황화증이 풍부한 형성을 보장하기 위해 세 가지 산화 단계에서 모두 촬영됩니다. 제 3 산화는 최적의 반응 시간을 초과할 때 이황화물 스크램블링이 발생할 수 있기 때문에 가장 중요합니다.
이제 두 번째 산화를 수행합니다. 동결 건조 펩타이드 15밀리그램을 이소프로판올 물 105밀리리터, 1개의 어금니 염산 혼합물에 녹입니다. 0.1 개의 어금니 요오드 용액의 158 마이크로 리터를 메탄올에 추가합니다.
산화가 완료될 때까지 실온에서 반응을 저어줍니다. 그런 다음 물에 하나의 어금니 아스코르브 산의 79 마이크로 리터를 추가하여 반응을 중지합니다. 마지막으로 세 번째 산화를 수행합니다.
폐기제 혼합물을 함유한 TFA의 5.5 밀리리터에 동결 건조 펩티드 15밀리그램을 녹입니다. 펩티드를 디틸 에테르 8~10밀리리터당 1밀리리터의 반응 용액에서 차가운 디틸 에테르를 함유한 튜브로 침전시한다. 15 밀리리터 튜브에 동결 건조 된 원유 제품의 15 밀리그램에서 펩티드 정제를 수행합니다.
0.1%TFA와 1대 1의 아세토나이트를 물에 혼합하여 HPLC 샘플 루프의 부피에서 원유 제품을 용해하십시오. 완전한 용해될 때까지 소용돌이를 피한 후, 원심분리기는 3400배G.에서 1분에서 3.6 밀리리터 혼합물을 5 밀리리터 주사기로 끌어올려 주입 루프에 기포없이 샘플을 주입한다. HPLC 시스템에 주입을 시작합니다.
분당 10 밀리리터의 유량으로 120분 이상 0~50%의 Eluent B의 그라데이션을 사용하여 펩티드 혼합물을 정화합니다. 개별 튜브의 분획을 수집합니다. 실행이 완료되면 텍스트에 설명된 대로 MS 및 HPLC 분석에 대해 선택한 분수를 준비합니다.
모든 분획을 동결건조하고 영하 20도에 보관하십시오. 분석 HPLC를 수행하기 위해 펩티드 분획 또는 반응 컨트롤의 샘플을 HPLC 바이알로 전송하고 1 대 1 의 아세토나이트에 0.1 %TFA의 혼합물에 용해하십시오. 각 샘플의 250 마이크로리터를 주입하도록 설정된 분석 역위 HPLC세트의 자동 샘플러에 HPLC 바이알을 배치합니다.
Eluent B.as Acetonitrile에서 0.1%TFA로 물에 0.1%TFA의 그라데이션 용출 시스템을 사용 하 여 10%에서 40%의 기울기를 사용하여 펩티드를 분당 1.0 밀리리터의 유량으로 30분 이상 분석한다. 아미노산 분석을 수행하기 위해 순수 펩타이드 100마이크로그램을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 6개의 어금니 HCL의 200마이크로리터에 분말을 용해한다. 용액을 유리 앰뮬레로 옮은 후, 분젠 버너 불꽃으로 목을 가열하여 앰펠을 닫습니다.
그런 다음 암페어를 가열 블록에 담근 유리 튜브를 가수 분해를 위해 섭씨 110도에서 24 시간 동안 가열 블록에 놓습니다. 24시간 후 앰프를 열고 용액을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮킨다. 원심 분리는 섭씨 60도에서 6시간, 회전 진공 농축기에서 210배 G로 솔루션을 제공합니다.
그런 다음 샘플링된 희석 버퍼의 192마이크로리터에서 가수분해된 제품을 용해하고 용액을 마이크로 원심 필터로 옮킨다. 2300회 G에서 1분 동안 시료를 원심분리한 후, 100마이크로리터의 여과를 아미노산 분석 샘플 튜브로 옮긴다. 튜브를 아미노산 분석기에 넣고 분석을 시작합니다.
이 과거 환원 프로토콜 동안, 대량 분석법을 통해 후속 디황화 분석에 필수적인 카파 미도 메틸화 종을 두 번 또는 4배 획득하기 위해 여러 반응 조절을 하는 것이 중요합니다. 먼저 TCEP를 함유한 0.05 개의 해선화 완충제의 1.2 밀리리터에 순수 펩티드 600 마이크로그램을 용해합니다. 0에서 30 분에 이르는 몇 가지 100 마이크로 리터 반응 제어 샘플을 복용 실온에서 혼합물을 배양.
1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 300 마이크로리터의 알킬화 버퍼에 샘플을 혼합하여 반응을 멈추고 무료 티올 그룹의 카보닐 메틸화를 수행합니다. 10%TFA와 물의 100 마이크로리터를 추가하여 5분 후에 반응을 멈추고 샘플을 드라이 아이스에 저장합니다. 이제 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 샘플에서 HPLC를 수행합니다.
산화 된 형태의 MS / MS 분석을 위해 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 수집 된 각 분획의 소량을 전송합니다. 남은 펩티드를 물에 0.1%TFA로 녹이고 100밀리머 TCEP 용액에 적절한 부피를 추가하여 최종 TCEP 농도10 밀리머를 얻습니다. 이 시점에서, 선택적 시스테인 알킬레이션은 펩타이드 시퀀싱을 통해 확인할 수 있다.
중간에 두 펩티드를 사용하면 이황화물 교량 패턴의 결정이 가능합니다. 상이한 이소종의 NMR 분석은 개별 펩티드 구조를 드러내기 위해 수행된다. 에너지가 가장 낮은 20개의 구조물과 다른 이소마의 이황화 연결이 표시됩니다.
특히, 이황화 연결의 명확한 식별을 위해 반전 단계 HPLC MS/MS 단편화 및 NMR 분석의 조합이 필요합니다. 루트 평균 제곱 편차 값의 비교는 강성 펩타이드가 주로 더 나은 NMR 구조로 이어진다는 것을 명확히 했다. 이 비디오는 당신에게 원하는 이황화물 결합 패턴으로 펩티드를 선택적으로 합성하는 방법을 예를 제공해야합니다.
또한 부드러운 질량 분광법을 통해 올바른 이황화 연결을 확인하고 NMR 분광법을 통해 3차원 구조를 얻을 수 있는 가능성을 보여줍니다. 개발 후, 이 기술은 펩티드 합성 분야의 연구자들이 3차원 구조에 대한 이황화물 결합 패턴의 중요성을 탐구하고 결과적으로 이러한 펩티드 이소머스의 활성을 탐구하는 길을 열어주었다. 이 절차에 이어, 활성 ASAS와 같은 다른 방법은 특정 생물학적 표적에서 상이한 펩타이드 이소머스의 구조 활성 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 수행될 수 있다.
이 방법은 코노톡신의 합성 및 분석에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 또한 펜젠, 이황파이드 풍부한 동물 독소 및 분자를 포함하는 다른 다중 시스테인과 같은 다른 디설파이드 브리지 펩티드 및 단백질에 적용 될 수있다.
