미토콘드리아 기능 장애는 많은 신경 퇴행성 질환의 근간을 이복합니다. 우리의 프로토콜은 축산기의 미토콘드리아 역학을 검사하기 위한 중요한 도구를 제공하여 축산 변성을 수반하는 신경 질환연구를 용이하게 합니다. 미토콘드리아 라벨링, 라이브 세포 이미징 및 유도된 다능성 줄기 세포 기술을 결합하여 우리의 프로토콜은 인간 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매를 특성화하고 그들의 형태를 분석하는 데 사용될 수 있습니다.
손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 줄기 세포 배양 및 이러한 질환 치료에 대한 잠재적 인 치료 목표를 제공하는 신경 퇴행성 질환의 동물 모델에서 관찰 될 수 있습니다. 문화의 35일 후에, 인간 유도한 다능성 줄기 세포에서 분화된 신경구를 37°C에서 2분 동안 1 mg/ml의 세포 분리 용액으로 작은 군집으로 해리합니다. 인큐베이션의 끝에서 원심분리에 의해 세포 클러스터를 수집하고 NDM의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.
폴리오니틴 과 유당 탈수소 효소 100 마이크로리터에 약 5개의 세포 클러스터를 플레이트하여 바이러스가 없는 감소된 성장인자 지하 막 매트릭스코팅 35mm 유리 바닥 접시. 그런 다음 B27, 순환 아데노신 모노인산염, 인슐린 과 같은 성장 인자, 인간 뇌 유래 신경 영양인 및 각 배양에 신경 세포 유래 신경 영양계인으로 보충된 NDM의 1밀리리터를 추가합니다. 선뇌 뉴런의 축축을 따라 미토콘드리아를 시각화하기 위해 NDM에서 37도에서 3분 동안 50나노몰러 적색 형광염으로 뉴런을 먼저 얼룩지게 하고 따뜻한 NDM에서 2개의 세차스를 넣습니다.
다음으로, 형광 현미경의 단계에 문화를 배치하고 40X 목표를 선택합니다. 위상 필드에서 그들의 형태학적 특성에 따라 축축을 식별합니다. 축축을 따라 미토콘드리아 운동의 방향을 구별하기 위해 뉴런의 세포 체를 명확하게 식별한다.
세포 체와 축축을 구별한 후 축선에서 미토콘드리아의 노출 시간과 초점을 조정하고 총 5분 동안 5초마다 축산 내의 미토콘드리아 수송을 포착한다. ImageJ 오픈 피지에서 미토콘드리아 수송을 분석하고 바이오 포맷 플러그인을 선택합니다. 바이오 포맷 가져오기를 사용하여 티프 시리즈의 타임랩스 이미지를 가져오고 표준 ImageJ 및 모든 계열을 엽니다.
자동 배율 분할 채널을 확인하고 확인을 클릭하여 픽셀단위로 이미지의 프레임 수와 크기를 기록합니다. 모든 60 프레임에 대한 밝기와 대비를 조정한 후 분할된 라인을 사용하여 셀 바디에서 단자 축슨으로 선을 그립니다. Kymograph를 생성하려면 여러 Kymograph 플러그인을 선택하고 라인 너비를 선택합니다.
움직이는 미토콘드리아 오픈 tsp050607의 거리, 시간 값 및 속도를 측정합니다. 매크로 플러그인에 txt. 그리고 열등한 부위로부터 키모그래프상미토콘드리아 운동의 흔적 위에 분할된 선을 그립니다.
선을 연 후 매크로 플러그인의 tsp에서 속도를 읽고 라인에 해당하는 분할 된 속도를 읽습니다. 다음은 원본 이미지를 열고 선 도구를 사용하여 배율 막대를 따라 선을 그립니다. 분석을 선택하여 선의 길이를 측정하고 현재 DX와 픽셀에서 마이크로미터까지 의 거리 단위를 변환합니다.
그런 다음 시간을 픽셀에서 초로 변경합니다. ImageJ에서 축축물 내의 미토콘드리아 길이 및 면적을 분석하려면 스트레이트 밑점 점 JAR 플러그인을 설치하고 축슨 이미지를 열어 관심 있는 이미지를 엽니다. 32비트 이미지를 8비트로 변환하고 분할된 선 도구를 사용하여 축축을 추적합니다.
스트레이트엔 밑줄 JAR 플러그인을 선택하고 필라멘트 와이드 라인의 너비를 50픽셀로 설정합니다. 축축을 다시 추적하여 곧게 펴진 축축을 생성하고 이미지 임계값을 조정합니다. 세트 측정을 분석경계에 맞는 타원과 형상 설명자를 선택하여 측정값을 설정하고 라인 함수를 사용하여 원래 이미지의 스케일 막대를 측정합니다.
분석 하 고 설정 하는 스케일픽셀 알려진 거리와 길이 단위로 거리를 입력 하여 스케일을 설정 합니다. 그런 다음 전역을 선택하여 모든 이미지로 스케일 설정을 설정합니다. 마지막으로 입자 를 분석하고 분석하여 영역을 결정하고 디스플레이 결과를 선택하여 결과 측정을 봅니다.
텔뇌스팔릭 글루타미테르기스 뉴런으로 분화한 후 세포는 T-B-R 1 및 베타 3tubulin 마커 발현을 특징으로 할 수 있다. 적색 형광염과 시간 경과 이미징으로 염색하면 미토콘드리아의 축산 운송을 평가할 수 있습니다. 단일 미토콘드리온은 축록소 내에서 정전기를 유지하거나 전방 또는 역행 방향으로 이동할 수 있습니다.
축축을 따라 미토콘드리아 운동의 속도는 도시된 바와 같이 정량화될 수 있다. 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 분석 소프트웨어를 사용하여 용이성 미토콘드리아의 백분율은 야생 형 뉴런에 비해 S-P-G-3-A 뉴런에서 현저히 감소된다. 미토콘드리아 영역 길이 및 종횡비 축축을 분석하기 위해 이미지 분석 소프트웨어에서 바로펴고 임계값을 조정하여 선택할 수 있다.
미토콘드리아 영역 둘레 길이 폭 및 종횡비는 곧게 펴진 축축으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 미토콘드리아 길이와 종횡비는 대조군 야생형 축축에 비해 S-P-G 15 뉴런 축록에서 현저히 감소된다. 매체와 현미경 인큐베이터를 따뜻하게 하여 세포를 부드럽게 씻고 세포가 이미징 전에 20 분 동안 안정되도록하는 것이 중요합니다.
살아있는 세포 화상 진찰 후에 배양은 관심있는 그밖 단백질의 발현을 검토하기 위하여 면역 염색을 고정식하고 복종할 수 있습니다. 살아있는 인간 신경에서 미토콘드리아 역학을 검사하는 것은 도전적입니다. 이 기술은 신경 질환의 미토콘드리아 역학 및 신경 변성의 연구를위한 독특한 도구를 제공합니다.
