우리는 린다 Hildegard Bergersen 및 액세스 Magnar Bjørås 세포 실험실 및 장비, 플라스 미드와 바이러스 생산 Janelia 분자 생물학 공유 리소스 직원 및 공원 Vervaeke 레이저 파워 측정에 대해 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이 건강 협회, 노르웨이 연구 위원회와 현미경 장비 Norbrain에 의해 투자 되었다.

<ol>
	<li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo.">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li><li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2++release+sites+in+oligodendrocyte+processes.">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li><li>Sterky, F. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths.">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage.">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li><li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate.">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li><li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development.">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Noraberg, J., Kristensen, B. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+tract+transduction:+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector.">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li><li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis.">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).</li></ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

여기서 설명 하는 organotypic 문화를 만들기 위한 프로토콜 드 Simoni와 유 (2006 년)5설명 하는 프로토콜의 수정된 버전18 이다. 가장 중요 한 변화는 아래 설명 된 했습니다. Tris 버퍼 문화 매체, 바이러스 성 변환 동안 인큐베이터 밖 때 조각의 생존과 셀 매체의 변화를 향상에 추가 됩니다. 색종이 대 한 살 균 절차 또한 변경 됩니다. 다른 프로토콜 압력가 마로 소독 하 여 색종이 소독 하는 동안 우리 권장 하지 않습니다이 때문에 그것은 여러 컬 색종이. 이러한 성장 조각 덜 건강 한 경향이 컬된 색종이 사용 하지 마십시오. 우리의 프로토콜 마우스를 사용 하 여, 아니 쥐, 그리고 해 마, 대신 피 문화 수정 우리는 얇은 조각 (230 µ m 대 300 µ m)에서 잘 작동. 출생 후 하루 10-20 쥐 및 쥐19, 문화에서 만든 myelination 봉우리로 쥐 p7-9 (고 후 11-14 일에 대 한 교양)은 myelinating oligodendrocytes를 공부 하 고 적합 합니다. 11 월 14 일 생체 외에서, 문화 소형 myelin 칼 집13여러 성숙 oligodendrocytes 포함 되어 있습니다. 젊은 쥐에서 만든 문화 문화 기간의 끝에 적은 성숙 oligodendrocytes를 포함 하는 것입니다, 그리고 반면 더 오래 된 쥐에서 만든 문화 더 건강 한20계속 도전 보여주었다.
Organotypic 조각 만들기 위한 절차는 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. 해 부와 두뇌의 장착으로 색종이에 분할 영역을 배치 할 수 있어야 합니다 신속 하 고 몇 가지 기술이 필요 합니다. 일반적으로, organotypic 슬라이스 문화 만들기 첫 번째 시도 보다 적게 성공적, 하지만 연습 2-3 라운드 건강 한 문화를 만들기 위해 필요한 기술을 습득 하기에 충분 해야한다. 그것은 문화의 오염을 방지 하는 절차를 통해 무 균 환경을 유지 해야 합니다. 또한, 살아있는 세포를 사용할 때는 올바른 pH 및 세포 건강을 유지 하기 위해 솔루션의 osmolality 필수적입니다 항상. 그것은, 그러므로, osmolality (270-310 mOsm/kg 있어야 함) 및 조각, 특히 처음으로 실험 하는 경우에 사용 되는 모든 솔루션의 산도 확인 하는 좋은 조언을. Organotypic 문화에 대 한 문화 및 해 부 솔루션 포함 산도 표시기 (페 놀 레드), 하지만 문화 매체에 노란색 세럼 낮은의 인상을 줄 수 있는 실제 pH 보다. 문화 매체에는 페니실린, 스, 그리고 Nystatin 감염의 기회를 최소화 하기 위해 포함 되어 있습니다. 따라서 organotypic 슬라이스 문화 기술 연구소, 설정할 때 이러한 항생제와 antimycotics를 사용 하 여 것이 좋습니다 하지만 전문가 무 균 기술을 적용 하는 경우에 나중에 피할 수 있다. 현재 프로토콜 셀 형태를 사용 하 여 세포 생존 능력을 평가. 더 양적 검사 조각은 로드할 수 있습니다 propidium 요오드 화물 또는 설명으로 유사한 염료 다른21. 그러나, 그것은 propidium 요오드 화물의 방출 스펙트럼 dsred, tdtomato 및 다른 빨간 표시기와 중복을 인식 하는 것이 중요. Propidium 요오드 화물 및 유사한 시 약의 또 다른 한계는 그들이 쉽게 따라서 셀5의 꼭대기 층에 세포 생존 능력의 평가 제한 하는 조각의 더 깊은 층은 입력 하지 않습니다.
다양 한 방법 유전자 배달에 대 한 존재합니다. 세포를 시각화 하기 위해 organotypic 조각 문화의 AAV 변환을 사용 하 여의 주요 장점은 다음과 같습니다: AAV 변환 비 바이러스 성 transfection 방법22와 비교 하는 postmitotic oligodendrocytes에 대 한 더 나은 성공을 평가 하고있다. 또한, organotypic 문화에서 모든 뇌 세포 유형은 존재, 그리고 oligodendrocytes는 그 본 vivo에서, 소형 myelin13를 포함 하 여 유사한 형태학. 이것은와 축 삭, 통신 부족 하 고 따라서 할 소형 myelin에 단, oligodendrocytes에서 다른입니다. 체 외에 이미징 쉽게 vivo에서 와 비교 하며 더 나은 공간적 해상도, 미토 콘 드리 아 같은 작은 세포 이미징 때 특정 관심의 인. 미래 연구는 이미지에 vivo에서, 하지만 좋은 지질이 풍부한 myelin 칼 집에 의해 발생 하는 광학 착오와 도전 얼굴을 하고자 합니다. 또한, AAV serotype 차 있는 굴곡 운동 및 발기인 특이성 vivo에서 그리고 생체 외에서 조건13,23사이의 달라질 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에 AAV2/8 MBP_mito_dsred와 AAV2/8 MBP_mito_GFP oligodendrocyte 미토 콘 드리 아를 시각화 하는 데 사용 됩니다. AAV serotype 2/1 또한 MBP_mito_dsred와 함께 테스트를 했다 하지만 organotypic 조각 (표시 되지 않음)에 oligodendrocytes의 낮은 수를 감염. AAV2/8 CAG_GFP와 AAV2/8 CAG_tdtomato oligodendrocyte 세포질을 시각화 하기 위해 사용 되었다. 불구 하 고이 대 한 일반적인 CAG 발기인을 사용 하 여, AAV 2/8 CAG_GFP와 CAG_tdtomato 선택적으로 감염 oligodendrocytes, 이다 감염 되 고 신경의 단지 작은 수 (이 수 쉽게 확인 될 그들의 독특한 형태에 의해). Oligodendrocytes에 대 한이 선택은 아마도 AAV 2/8 serotype24차 있는 굴곡 운동 때문 이다. 그러나, 식 세포 기관이 대상 높은 세포 특이성을 달성 MBP-또는 다른 oligodendrocyte 특정 발기인 것이 좋습니다. 우리가 CAG_GFP 테스트 다른 serotypes AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, 대부분의 주로 뉴런을 이다 (표시 되지 않음)를 감염 했다.
구성 및 실험 조건에 따라 셀 변환의 수정이 필요할 것 이다. Transduced 셀 표시 너무 희미 식 증가 변환 후를 더 긴 시간에 시험관에 보십시오. 셀 밝은 하지만 건강에 해로운 경우, 변환 후 시간을 줄일. 아주 몇몇 세포 transduced는 AAV의 농도 높일 수 있습니다. 그러나, 그것은 또한 변환 후 생체 외에서 시간 너무 오래 하 고 세포 transduced 죽었을 가능입니다. 여기에 사용 되는 구문에 대 한 식 레벨 변환 후 최적의 4-6 일을 했다. 변환 후 7-8 일에 셀 등장, blobby 프로세스와 덜 건강 한 그리고 변환, 후에 10 일 (표시 되지 않음) 몇 transduced 셀만 표시 했다.
이 프로토콜 organotypic 조각의 라이브 이미징에 대 한 직 립 현미경을 사용합니다. 이 대부분 모노 다릅니다-그리고 일반적으로 거꾸로 한 현미경을 사용 하는 공동 문화. 그것은 아마도 덜 건강 하 게 슬라이스를 위쪽으로 직면 하 고 색종이와 다음 슬라이스를 설정 해야 합니다 때문에 여기는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 차선. 똑바로 현미경의 장점 중 하나입니다 설정 전기 생리학을 추가할. 또한, 매체를 변경 하려면 펌프의 사용을 마약 솔루션 수 있습니다 쉽게 추가 및 제거할 시간 경과 영상 중 의미 합니다. 펌프와 불리는 진동 및 전류 목욕에 의해 발생 하는 초점을 유지 하는 문제 이다. 현미경, 세포 점차적으로 될 것 이다 더 적은건강 한. 우리는 그러므로 1 시간 최대에 대 한 현미경 조각 유지. 이미지 분할 영역 (특수 폐기물) 멀리 던져 있습니다. 이미징 조건에 최적의 되도록 병렬 제어 세포에 있는 미토 콘 드 리아 운동은 이미 잘 특징 이다의 이미지를 실행 해야 합니다. 여는 몇 군데 수 있습니다 예를 들어, 미토 콘 드 리아 운동 축 삭 또는 모 수석에 대 한 시험 조각 2/1 Syn_mito_dsred (어떤 dsred에 식에 의해 구동 됩니다 신경 관련 synapsin 발기인) 또는 AAV AAV와 (뒤에 immunostaining 2/1 CAG_mito_dsred 셀 정체성 확인). 미토 콘 드 리아 운동의 분석을 수행할 수 있습니다 ImageJ25설명 되어 있는 대로 여러 kymograph 도구를 사용 하 여.
여기 우리는 라이브 이미징 동안 흠 없는 myelin의 시각화에 대 한 핵심을 설명합니다. 점수9, 3 개의 흥분 파장을 사용 하에 비해 코어만 사용 하 여 하나 (488 nm)은 이렇게 구현 하는 간단 하 고. 점수, 3 파장 각 다른 "조각" myelin 칼 집과 함께 주고 칼 집의 전체 이미지를 공개. 또한, 세포질 주머니 같은 myelin 칼 집 구조를 검출 하기 위하여 점수를 사용할 수 있습니다. 코어에 사용 되는 단일 파장, 덜 상세 보기 고과 립 또는 불연속 sheaths 나타날 수 있습니다 (그림 3). 그럼에도 불구 하 고, 코어는 거의 100%의 시야를 가로 myelin 칼 집의 시각화. 따라서, 코어는 myelin 칼 집의 검출에 대 한 하지만 myelin 구조 또는 무결성의 분석에 유용 합니다.

뇌의 백색 질은 신경 세포 축 삭은 수 초, oligodendrocytes에 의해 형성 된 특수 확장된 원형질 막에에서 싸여 구성 되어있습니다. Myelin는 신속 하 고 안정적인 활동 전위 전파 및 myelinated 축 삭의 장기 생존을 위한 필요 그리고 myelin의 손실 신경 장애를 일으킬 수 있습니다. 그들의 중요성에도 불구 하 고 oligodendrocytes의 속성은 덜 알려진 비교 신경와 이다. 따라서, 적은 도구 oligodendrocytes 공부에 대 한 개발 되었습니다.
라이브 셀 세포의 영상 같은 미토 콘 드리 아, endoplasmatic 그물 (응급실) 또는 다른 기공을 구조 유용할 수 있습니다 시간이 지남에 세포에서 동적인 변화를 공부 하. 전통적으로, 생활 oligodendrocytes의 이미징 monocultures1,2에서 수행 되었습니다. 그러나, 단에 oligodendrocytes 소형 myelin, 표시 되지 않습니다 그리고 organotypic 또는 급성 뇌 조각 있을 수 있습니다, 따라서, 더 나은 옵션 지역화 및 세포의 움직임을 공부 하는 경우. 작은 세포 myelin 칼 집에 있는 단백질의 지역화는 myelinated 축 삭과 주변 myelin 칼 집 사이 짧은 거리 때문에 전하실 수 있습니다. 따라서, 가벼운 현미경 immunostaining 절차 혼자 myelinated 축 삭에 myelin 칼 집에 세포 사이 차별을 공간 해상도 있지 않습니다. 이 셀 형식 관련 발기인에 의해 구동 세포 기관이 대상 형광 단백질을 위한 유전자와 바이러스 성 변환에 의해 해결 될 수 있습니다. 이점은 셀 및 스파스 식 세포 기관이 현지화 및 역학의 정확한 평가 가능 하 게 있다. 유전자 변형 동물 같은 한 세포 기관이 대상 셀 특정 식3을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 생산 및 유전자 변형 동물의 유지 보수 비용이 이며 일반적으로 바이러스 성 방법으로 얻을 수 있는 스파스 식 제공 하지 않습니다.
설명 하는 방법을 여기 미토 콘 드 리아-타겟 형광 성 단백질 (dsred 또는 녹색 형광 단백질, GFP)와 oligodendrocytes (MBP-미토-dsred 또는 MBP-미토-GFP) 시각화를 myelin 기본적인 단백질 발기인에 의해 구동의 바이러스 성 변환 사용 organotypic에 있는 oligodendrocyte 미토 콘 드리 아 두뇌 조각. 또한, 다른 형광 단백질 (GFP 미토-dsred 함께 사용 또는 tdtomato 미토 GFP를 사용한) 세포질에서의 표현 myelin 칼 집의 세포질 구획을 포함 하 여 세포 형태학의 시각화를 가능 하 게 하는 데 사용 됩니다. 프로토콜은 organotypic 뇌 조각 (드 Simoni와 유, 20064,5설명 하는 프로토콜의 수정된 버전)를 만들기 위한 절차를 포함 됩니다. 우리는 다음 미토 콘 드 리아 운동 공부 시간 경과 이미징 절차를 설명 합니다. 이 절차는 영상 매체, 영상 중 마약 또는 다른 중간 변경의 쉬운 응용 프로그램을 가능 하 게 설정의 지속적인 교류와 직 립 confocal 현미경을 사용 합니다. 시간 경과 화상 진 찰 절차는 아래에 설명 된 살아있는 조각을 유지 하기 위한 몇 가지 여분의 장비와 함께 어떤 confocal 현미경에 수행할 수 있습니다. 프로토콜에는 이미지를 최적화 하 고 phototoxicity를 줄일 여러 팁을 포함 되어 있습니다.
마지막으로, 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어)으로 흠 없는 수 초를 시각화 하는 빠르고 간단한 방법을 설명 합니다. 이 라이브 이미징 동안 myelin 칼 집을 식별 하려면 유용할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 여러 기술을 어떤 얼룩 필요 없이 이미지 myelin를 개발 되었습니다 하지만 대부분의 필요 특정 장비 및 전문6,,78. 여기에 설명 된 절차 myelin 칼 집의 반사 속성을 사용 하 여 고 스펙트럼 Confocal 반사율 현미경의 단순화 된 단일 여기 파장 버전 (점수, 있는 몇몇 파장 레이저 결합 되어 수 초를 시각화) 9. 코어 488 nm 레이저와 470-500 nm 대역 방출 필터 또는 가변 배기 필터 어떤 confocal 현미경에서 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A9539</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:167px;">BD Microlance 19G</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:125px;">301500</td>
			<td style="width:171px;">Needles used for in- and outlet of bath</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">Bioxide gas</td>
			<td style="width:139px;">AGA</td>
			<td style="width:125px;">105701</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">Brand pipette bulbs</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">Z615927</td>
			<td style="width:171px;">Pipette bulbs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:167px;">Bunsen burner (Liquid propane burner)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">89038-530</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0106&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller - thermometer part</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">CaCl2</td>
			<td style="width:139px;">Fluka</td>
			<td style="width:125px;">21100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">CO2&#160;</td>
			<td style="width:139px;">AGA</td>
			<td style="width:125px;">100309</td>
			<td style="width:171px;">CO2 for incubator</td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:167px;">Cover glass, square Corning</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">13206778</td>
			<td style="width:171px;">To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G7021</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Delicate forceps</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">11063-07</td>
			<td style="width:171px;">For dissection</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:167px;">Diamond scriber pen</td>
			<td style="width:139px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:125px;">54463</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:167px;">Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">612-1702</td>
			<td style="width:171px;">Glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Double edge stainless steel razor blade</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#7200</td>
			<td style="width:171px;">Razor blade for vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:167px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">24010-043</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Filter paper circles</td>
			<td style="width:139px;">Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td style="width:125px;">300,220</td>
			<td style="width:171px;">Filter paper used for filtration of PFA</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Fun tack</td>
			<td style="width:139px;">Loctite</td>
			<td style="width:125px;">1270884</td>
			<td style="width:171px;">Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Hand towel C-Fold 2</td>
			<td style="width:139px;">Katrin</td>
			<td style="width:125px;">344388</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:167px;">Harp, Flat for RC-41 Chamber,</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">&#160;64-1418</td>
			<td style="width:171px;">Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:167px;">HEPES, FW: 260.3</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H-7006</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:167px;">Holten LaminAir, Model 1.2</td>
			<td style="width:139px;">Heto-Holten</td>
			<td style="width:125px;">96004000M</td>
			<td style="width:171px;">Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Horse serum, heat inactivated</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">26050-088</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">KCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P9541</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:167px;">LCR Membrane, PTFE,&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">FHLC0130</td>
			<td style="width:171px;">Confetti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Leica VT1200</td>
			<td style="width:139px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">14048142065</td>
			<td style="width:171px;">Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">MEM-Glutamax with HEPES</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">42360024</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">MgCl2</td>
			<td style="width:139px;">R.P. Normapur</td>
			<td style="width:125px;">25 108.295</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Micro Spoon Heyman Type B</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">62411-B</td>
			<td style="width:171px;">Small, rounded spatula with sharpened end for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Millex-GP filter unit</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">SLGPM33RA</td>
			<td style="width:171px;">Syringe filter unit</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:167px;">Millicell cell culture insert, 30 mm</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">PICM03050</td>
			<td style="width:171px;">Cell culture inserts</td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:90px;width:167px;">Minipuls 3 Speed Control Module</td>
			<td style="width:139px;">GILSON</td>
			<td style="width:125px;">F155001</td>
			<td style="width:171px;">Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S7907</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S9888</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S8282</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:139px;">Fluka</td>
			<td style="width:125px;">71628</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:167px;">Nunclon Delta Surface</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">140675</td>
			<td style="width:171px;">Culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">Nystatin Suspension</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">N1638</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:93px;width:167px;">Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 40x/1.0 DIC&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Zeiss</td>
			<td style="width:125px;">441452-9900-000&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Parafilm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">291-1211</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Paraformaldehyde, granular</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#19208</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:167px;">PC-R perfusion chamber</td>
			<td style="width:139px;">SiSkiYou</td>
			<td style="width:125px;">&#160;15280000E</td>
			<td style="width:171px;">Bath for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Penicillin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">15070-063</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Petri dish 140 mm&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Heger</td>
			<td style="width:125px;">1075</td>
			<td style="width:171px;">Large Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:167px;">Petri dish 92x16 mm&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sarstedt&#160;</td>
			<td style="width:125px;">82.1473</td>
			<td style="width:171px;">Medium Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">Petridish 55x14,2 mm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">391-0868</td>
			<td style="width:171px;">Small Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4417</td>
			<td style="width:171px;">PBS tablets</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">R2 Two Channel Head&#160;</td>
			<td style="width:139px;">GILSON</td>
			<td style="width:125px;">F117800</td>
			<td style="width:171px;">Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:167px;">Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">82027-528</td>
			<td style="width:171px;">Large spatula for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Sand paper</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">MMMA63119</td>
			<td style="width:171px;">Optional, for smoothing broken glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Scissors,&#160; 17,5 cm</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">14130-17</td>
			<td style="width:171px;">Large scissors for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Scissors, 8,5&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">14084-08</td>
			<td style="width:171px;">Small, sharp scissors for&#160; dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Single edge, gem blade</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#71972</td>
			<td style="width:171px;">Single edge razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:167px;">Single inline solution heater SH-27B</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0102</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller - heater part</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:171px;">Filter to sterilize solutions</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:167px;">Super glue precision</td>
			<td style="width:139px;">Loctite</td>
			<td style="width:125px;">1577386</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Surgical scalpel blade no. 22</td>
			<td style="width:139px;">Swann Morton Ltd.</td>
			<td style="width:125px;">209</td>
			<td style="width:171px;">Rounded scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:167px;">Temperature controller TC324B</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0100</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">Trizma base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:125px;">T1503</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Trizma HCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">T3253</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:167px;">Water jacketed incubator series II</td>
			<td style="width:139px;">Forma Scientific</td>
			<td style="width:125px;">78653-2882</td>
			<td style="width:171px;">Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and live imaging of oligodendrocyte organelles in organotypic brain slices using adeno-associated virus and confocal microscopy

전기 절연 및 myelinating oligodendrocytes의 영양 지원에 의존 하는 신경. Oligodendrocytes의 중요성에도 불구 하 고 현재 뉴런, 공부 하는 데 사용 하는 고급 도구 oligodendrocyte 연구원 촬영 부분적으로 있다. 셀 형식-특정 바이러스 성 변환에 의해 얼룩 라이브 세포 기관이 역학을 공부 하는 유용한 접근 이다. 이 문서 변환 adeno 관련 바이러스 (AAV)의 transcriptional 통제 미토 콘 드 리아 타겟된 형광 단백질을 위한 유전자를 나르는 여 organotypic 뇌 조각에서 oligodendrocyte 미토 콘 드리 아를 시각화에 대 한 프로토콜 설명 myelin 기본적인 단백질 발기인입니다. Organotypic 코로나 마우스 뇌 조각을 만들기 위한 프로토콜을 포함 합니다. 다음에 미토 콘 드리 아의 시간 경과 영상에 대 한 절차는 다음과 같습니다. 이러한 메서드는 다른 세포로 옮겨질 수 있다 그리고 세포 myelin 칼 집에서 공부 하는 데 특히 유용 수 있습니다. 마지막으로, 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어)에 의해 생활 조각에 흠 없는 myelin의 시각화에 대 한 쉽게 사용할 수 있는 기술을 설명합니다. 코어 불필요 한 장비를 필요 하며 라이브 이미징 동안 myelin 칼 집을 식별 하려면 유용할 수 있습니다.

경작 하 고 위에서 설명한 대로 불리고 Organotypic 뇌 조각 대뇌 피 질의 oligodendrocytes mito_dsred와 GFP의 스파스 배포를 보였다. Olig2와 MBP에 대하여 항 체와 Immunostaining 확인 식 oligodendrocytes (그림 1)를 특정 했다.
라이브 이미징, 불리고 oligodendrocytes 병렬 (그림 1 및 그림 2A)에서 실행 되는 여러 myelin 칼 집의 그들의 독특한 형태에 의해 인식 되었다. Transduced oligodendrocytes에 영상 시간 경과 수행 하 여 기본 프로세스 및 myelin 덮개 (그림 2B-D)에서 미토 콘 드리 아의 움직임을 모니터 가능 하다.
낮은 GFP 식 셀, myelin 칼 집 식별할 수 라이브 영상 중 488에서 샘플을 조명 하 여 방출 캡처 및 빛 470-500 nm (그림 3A). 이 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어) 기술은 또한 고정 하는 PFA 및 immunostained 조직에 근무 하지만 myelin 칼 집 등장된 주차 (그림 3B-C). Myelin 기본적인 단백질 (MBP)에 대 한 항 체와 immunostaining에 의해 우리가 발견 누워 myelin 칼 집의 100% (화살촉, 그림 3B-C로 표시) 영상 평면에 수평 반면 수 초 코어, 볼 수 있습니다 보기의 필드 (별표, 그림 3B-C로 표시)에 그 위치 수직 또는 전혀 볼 수 있습니다. 거의 모든 internodes 시각화는 비록 많은 internodes 불연속, 칼 집 표시 되지 (그림 3A 삽입)의 작은 부분으로 나타납니다. Myelin에 이러한 작은 "간격" 3 개의 상호 보완적인 파장, 소위 점수9영상으로 채울 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56237/56237fig1.jpg"> 
그림 1 : Immunohistochemistry MBP-미토-dsred oligodendrocytes Olig2와 MBP에 대 한 면역 양성에서 표현 선택적으로 확인 합니다.  (AAV2/8) 불리고 MBP-미토-dsred (빨강, 미토 콘 드 리아 마커)와 CAG-GFP (녹색, cytosol) 교양된 마우스 뇌 조각의 피 질에서 이미지는. 조각 했다 myelin 마커 Myelin 기본적인 단백질 (MBP, 파란색) 및 Olig2 immunolabeled (oligodendrocyte 계보 세포 핵 마커, 마젠타색). (그림13참조 수정) <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56237/56237fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56237/56237fig2.jpg"> 
그림 2 : Oligodendrocytes에서 미토 콘 드리 아의 움직임을 추적 하 시간 경과 영상. (A) MBP_mito_dsred (빨간 미토 콘 드리 아)와 CAG_GFP (그린 형광) 불리고 oligodendrocyte의 z-스택 (광학 섹션 10.35 µ m)의 투영. (B) 단일 confocal (광학 섹션 1.04 µ m)의 이미지 같은 셀입니다. 스퀘어 시간 경과 영상 (C) 선정 된 지역 나타내고 (d) kymographs (김) 하 게 그려진 라인 표시 됩니다. 시간 경과 기록의 A 셀에서 (C) 이미지와 B 다른 시간 지점에서 촬영. 이동 미토 콘 드리 아에는 표시 (빨간색 화살표)입니다. 궤도에서 (D) Kymographs (B)에 표시 된. 고정 된 미토 콘 드리 아 똑바로 수직 선으로 볼 수 있습니다 그리고 이동 미토 콘 드리 아 대각선으로 볼 수 있습니다. Kymographs, 그리고 (C)에서 시간-코스 이미지에서 볼 수 있는, Kymograph 1 (김 1)를 표시 하는 기본 과정에서 미토 콘 드리 아만 있습니다. 다른 3 개의 kymographs에서 미토 콘 드리 아 시간 경과 기록 동안 고정 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56237/56237fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56237/56237fig3.jpg"> 
그림 3 : 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어)으로 흠 없는 myelin의 시각화. 라이브 organotypic 뇌 조각의 피 질에서 z-스택 (광학 섹션 10.35 µ m)의 (A) 프로젝션. (녹색 세포 본문) 그림과 oligodendrocyte에 GFP 식이입니다 기본 프로세스 및 수 초의 식별을 위해 너무 희미. 대신, 수 초 488 nm에서 여기 및 470-500 nm (자홍색으로 표시)에서 캡처 내보낸된 빛으로 시각화 했다. GFP + oligodendrocyte의 세포질이 풍부한 paranodes의 일부 myelin internodes (화살표)의 끝에서 볼 수 있습니다. 삽입: myelin 칼 집의 확대 부분을 코어 시각 myelin 나타납니다 보여줍니다 "누 덕 누 덕" 또는 불연속 (자세한 내용은 본문 참조). (B-C) Confocal 지층 radiatum 해 마 CA1의 고가 (B)에서 (C)의 이미지 4 %PFA 및 myelin 기본적인 단백질 (MBP)에 대 한 immunostained에서 해결 되었습니다는 급성 마우스 뇌 조각. 반면 시야 (별표)에 수직인 sheaths는 가장 자주 보이지 Horisontal myelin 칼 집 (화살촉) 코어, 볼 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56237/56237fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
시 약 테이블: <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56237/REAGENTS_table_Kennedy_and_Rinholm_april.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Myelinating oligodendrocytes는 급속 한 활동 전위 전파 및 신경 생존을 촉진합니다. 여기에 설명 된은 organotypic에 형광 단백질의 oligodendrocyte 특정 식에 대 한 프로토콜 후속 시간 경과 화상 진 찰과 뇌 조각입니다. 또한, 흠 없는 수 초를 시각화에 대 한 간단한 절차 제공 됩니다.

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

visualization-live-imaging-oligodendrocyte-organelles-organotypic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K 조회수.  University of Oslo. Myelinating oligodendrocytes는 급속 한 활동 전위 전파 및 신경 생존을 촉진합니다. 여기에 설명 된은 organotypic에 형광 단백질의 oligodendrocyte 특정 식에 대 한 프로토콜 후속 시간 경과 화상 진 찰과 뇌 조각입니다. 또한, 흠 없는 수 초를 시각화에 대 한 간단한 절차 제공 됩니다.

비디오: Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various heterologous genes could thus be investigated easily while maintaining many aspects of in vivo biology. There has been increasing interest to transfect terminally differentiated neurons for which conventional transfection methods have been fraught with difficulties such as low yields and significant losses in viability. Biolistic transfection can circumvent many of these difficulties yet only recently has this technique been modified so that it is amenable for use in mammalian tissues.
New modifications to the accelerator chamber have enhanced the gene gun&#39;s firing accuracy and increased its depths of penetration while also allowing the use of lower gas pressure (50 psi) without loss of transfection efficiency as well as permitting a focused regioselective spread of the particles to within 3 mm. In addition, this technique is straight forward and faster to perform than tedious microinjections. Both transient and stable expression are possible with nanoparticle bombardment where episomal expression can be detected within 24 hr and the cell survival was shown to be better than, or at least equal to, conventional methods. This technique has however one crucial advantage: it permits the transfection to be localized within a single restrained radius thus enabling the user to anatomically isolate the heterologous gene&#39;s effects. Here we present an in-depth protocol to prepare viable adult organotypic slices and submit them to regioselective transfection using an improved gene gun.

Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.

위치 선택성과 유전자는 수정 된 유전자 총을 사용의 Organotypic 뇌 조각에 타겟팅

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. Using subpially-placed polyethylene catheters (PE-10 or PE-5) for AAV9 delivery, potent transgene expression through the spinal parenchyma (white and gray matter) in subpially-injected spinal segments has been demonstrated. Because of the wide range of transgenic mouse models of neurodegenerative diseases, there is a strong desire for the development of a potent central nervous system (CNS)-targeted vector delivery technique in adult mice. Accordingly, the present study describes the development of a spinal subpial vector delivery device and technique to permit safe and effective spinal AAV9 delivery in adult C57BL/6J mice. In spinally immobilized and anesthetized mice, the pia mater (cervical 1 and lumbar 1-2 spinal segmental level) was incised with a sharp 34 G needle using an XYZ manipulator. A second XYZ manipulator was then used to advance a blunt 36G needle into the lumbar and/or cervical subpial space. The AAV9 vector (3-5 &#181;L; 1.2 x 1013 genome copies (gc)) encoding green fluorescent protein (GFP) was then injected subpially. After injections, neurological function (motor and sensory) was assessed periodically, and animals were perfusion-fixed 14 days after AAV9 delivery with 4% paraformaldehyde. Analysis of horizontal or transverse spinal cord sections showed transgene expression throughout the entire spinal cord, in both gray and white matter. In addition, intense retrogradely-mediated GFP expression was seen in the descending motor axons and neurons in the motor cortex, nucleus ruber, and formatio reticularis. No neurological dysfunction was noted in any animals. These data show that the subpial vector delivery technique can successfully be used in adult mice, without causing procedure-related spinal cord injury, and is associated with highly potent transgene expression throughout the spinal neuraxis.

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

The goal of the present study was to develop and validate the potency and safety of spinal adeno-associated virus 9 (AAV9)-mediated gene delivery by using a novel subpial gene delivery technique in adult mice.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...