우리의 프로토콜은 동일하거나 반대 방향 사이토스켈레탈 모터 단백질의 팀에 의해화물의 운송을 지배하는 생물 물리학 메커니즘을 조사하도록 설계되었습니다. 분자 구조에 DNA 종이 접기를 사용 하 여, 이 방법은 정확 하 게 정의 된 화물 모양에 모터의 종류, 수, 그리고 위치에 대 한 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마이크로튜블러 기반 모터 다인과 키네신에 초점을 맞추고 있지만, 액틴 기반 모터 묘신뿐만 아니라 협력적으로 작동하는 다른 단백질 시스템에 적응할 수 있습니다.
이 프로토콜의 한 가지 어려운 측면은 열및 기계적 힘에 민감하기 때문에 정제 공정 전반에 걸쳐 모터 단백질의 무결성과 활동을 유지하는 것입니다. 갈라토제 프로모터를 통한 모터 단백질 성장 및 발현을 유도하기 위해, 멸균 접종 지팡이를 사용하여 효모-펩톤-덱스트로스 배양 판에 대한 관심의 얼어붙은 효모 균주를 30°C에서 3-4일 간 배양한다. 배양 4일째에 600나노미터의 광학밀도가 1.5~2년 사이일 때, 원심분리에 의해 효모세포를 수집하고, 이를 세척하고 세포를 한 병에 통합하기 위해 물에서 펠릿을 재연한다.
수집을 위해 세포를 다시 회전시키고, 이중 증류수의 약 2 밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 세포 슬러리를 액체 질소 1방울로 천천히 분배하여 냉동 효모 세포 펠릿을 생성합니다. 모터 단백질 정제를 위해 액체 질소로 미리 냉각된 블레이드 형 커피 그라인더를 사용하여 냉동 효모 펠릿을 미세 한 분말로 갈아서 효모 분말을 얼음 위에 100 밀리리터, 유리 비커로 옮춥니다.
완충제의 최종 농도가 1X를 초과하지 않도록 분말에 보충제를 사용하여 소량의 갓 준비된 4X 용해 버퍼를 추가하고, 주걱으로 연속 교반하여 37도 의 수조에 비커를 배치하여 분말을 빠르게 해동시합니다. 보충교재와 함께 추가 4X 버퍼를 추가하여 최종 버퍼 농도를 1X로 끌어올래로 연결합니다. 최종 볼륨은 종종 사이 25 그리고 30 밀리 리터.
그런 다음 원심분리에 의해 효모 세포를 수집하고, 얼음에 새로운 50 밀리리터 원피스 튜브로 슈퍼나탄을 함유하는 용해성 단백질을 전달한다. IgG 선호도 정제의 경우, 200 마이크로리터의 세척된 친화성 비드 현탁액을 단백질 추출물에 넣고, 부드러운 회전으로 1시간 동안 섭씨 4도에서 혼합물을 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 구슬을 준비하는 데 사용되는 동일한 크로마토그래피 컬럼을 통해 혼합물을 필터링하고 얼음에 세척당 세척 버퍼 5 밀리리터가 있는 2개의 세척을 합니다.
두 번째 세척 후, TEV 버퍼의 5 밀리리터와 얼음에 구슬을 헹구어 버퍼가 열에서 완전히 배출할 수 있도록 합니다. DNA 올리고뉴클레오티드 라벨링의 경우 크로마토그래피 컬럼을 캡팅하고, 10~15분 동안 실온에서 정제된 벤질구아닌 올리고의 10~20마이크로몰라로 보충된 TEV 버퍼 100 마이크로리터로 모터 비즈를 배양하여 1분에 한 번 부드럽게 비드를 재연한다. 인큐베이션이 끝나면, 튜브 의 바닥을 재조정하기 전에 200 마이크로리터의 신선한 TEV 버퍼로 모터 구슬의 재서스펜션을 허용하기 전에, 세척당 신선한 TEV 버퍼로 구슬을 네 번 세척하십시오.
TEV 골짜기의 경우 모터 비드 서스펜션을 2밀리리터, 라운드 하부, 미세센심분리기 튜브로 옮기고 모터 비드 혼합물의 마이크로리터당 약 0.3단위로 모터 비드를 16°C의 부드러운 회전으로 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 모터 구슬원심분리하고 튜브의 바닥에 혼합물을 수집합니다. 다음으로, 절단 P1000 파이펫 팁을 사용하여 혼합물을 스핀 컬럼으로 옮기고, 방금 입증된 혼합물을 원심분리한다.
미세투막 선호도 정화를 위해 TEV-클리브, 정제 모터 및 알리쿼트에 50 마이크로리터 부피로 여과물을 포함하는 여과물을 수집합니다. 그런 다음 액체 질소에 알리쿼트를 동결하여 섭씨 80도까지 보관합니다. 섀시 정화를 위해, 정화 전날 늦은 오후에, 원심분리기 튜브내 종이 접기 접이식 완충제에서 글리세롤의 각 농도 80 마이크로리터를 부드럽게 층화한다.
레이어 사이의 경계가 약간 표시되어야 합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한 후, 그라데이션의 상부 층 위에 접힌 섀시 용액의 종이 접기 접이식 버퍼에 10% 글리세롤을 층으로, 섀시로 그라데이션을 원심분리한다. 원심 분리의 끝에서, 상부에서 하단 방향으로 그라데이션의 50 마이크로 리터 분획을 수집하고, 2 % 아가로즈 젤의 개별 우물에 각 분획의 다섯 마이크로 리터를로드합니다.
70볼트에서 90~120분 후에, 사용된 DNA 젤 얼룩에 적합한 조건을 사용하여 젤을 이미지한다. 선택된 분획의 정량화된 농도는 적절한 표준 분광 방법을 사용하여 결정될 수 있다. SDS-PAGE 분석은 최종 여과가 약 350킬로달톤의 명확하고 날카로운 밴드를 나타내기 때문에 효모로부터 다인의 성공적인 추출을 확인하는 데 사용될 수 있다.
TEV 프로테아제는 또한 최종 여과에 존재하며 약 50 킬로달톤에서 선명한 밴드를 형성합니다. 마이크로투불 친화성 정화 후, 다인은 350킬로달톤의 투명 한 단일 밴드로 나타나며, 키네신은 약 120 킬로달톤에서 약간 번짐, 여러 밴드로 관찰 될 수 있습니다. TEV 프로테아제 외에도 최종 상부에서 눈에 띄는 양의 튜룰린을 관찰할 수 있습니다.
DNA 종이 접기 구조의 접는 순수한 전개 된 스캐폴드 가닥과 종이 접이식 접이식을 나타내는 접이식 반응 사이의 이동성의 변화와 함께 아가로즈 젤 전기 포에 의해 분석 될 수 있습니다. 또한 접이식 반응은 섀시 구조의 일부 다중 수화의 존재를 나타냅니다. 7개의 다인 단백질에 결합된 유연한 섀시 의 키모그래프가 비교적 일관된 속도로 고도로 처리되는 주행을 보여주기 때문에 모터 섀시 앙상블의 운동성은 TIRF 영화에서 생성된 kymographs에서 쉽게 감지가능하고 측정할 수 있습니다.
절차의 각 단계에서 모터 단백질의 온도를 주의 깊게 제어하는 것이 중요합니다. 모터 단백질과 DNA 종이 접기 섀시의 정제에 따라, 두 성분은 TIRF 현미경의 밑에 앙상블의 운동성 분석에 대해 공질될 수 있다. 이 방법은 모터 앙상블의 비상 적인 운동성을 제어하는 생체 물리학 및 생화학 적 메커니즘을 해독 할 수 있게합니다.
