세포막은 내장 된 단백질과 당의 존재로 인해 매우 혼잡합니다. 우리는 합성 밀집된 지지 지질 이중층에 대한 단일 분자 이미징을 시연합니다. 이 플랫폼은 분자 수준에서 막 생체 분자 반응에 대한 군집의 영향을 조사하는 데 유용합니다.
이 프로토콜은 막 생체 분자의 결합, 확산 및 조립 분석을 설명합니다. 실험의 성공 여부는 기판의 엄격한 세척, 이중층 손상 방지, 단일 분자 이미징에서 높은 신호 대 잡음비 유지에 달려 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 Aditya Upasani와 Vishwesh Haricharan Rai, 실험실의 대학원생입니다.
플라즈마 처리된 아크릴 슬라이드를 깨끗한 티슈 페이퍼에 올려 놓는 것으로 시작합니다. 양면 레이저 절단 테이프를 벗겨 슬라이드에 붙입니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프를 평평하게 하여 한 채널에서 다른 채널로 누출되지 않도록 합니다.
플라즈마 처리된 커버 슬립을 테이프로 붙인 슬라이드에 놓아 챔버를 닫습니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프 영역의 커버 슬립을 부드럽게 눌러 채널을 방수 처리합니다. 유리 슬라이드를 사용하는 경우 에폭시 수지를 사용하여 가장자리를 밀봉하십시오.
준비된 미세유체 이미징 챔버를 건조된 조건에서 1-2주 동안 보관하십시오. 피라냐 용액을 사용하여 미리 세척 한 유리 바이알을 가져 와서 버퍼를 첨가 한 후 PEG 2000 지질의 원하는 몰 분율에서 POPC 및 DOPE-PEG (2000)의 클로로포름 용액을 첨가하여 최종 지질 농도 3 밀리몰을 얻습니다. 유사하게 지질의 다른 막 조성물이 제조될 수 있다.
다음으로, 원하는 지질이 바이알 표면에 균일하게 코팅되도록 작은 소용돌이가있는 부드러운 질소 스트림을 사용하여 바이알에서 클로로포름을 건조시킵니다. 바이알을 진공 데시케이터에 1시간 동안 보관하여 잔류 클로로포름을 제거합니다. 그런 다음 1 밀리리터의 PBS를 바이알에 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.
밤새 배양 한 후 용액이 탁하고 유백색이 될 때까지 1-2 분 동안 바이알을 부드럽게 휘젓습니다. 이제 100 마이크로 리터의이 용액을 작은 500 마이크로 리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 50 내지 100 나노미터 직경의 작은 단층 소포를 생성하려면 배스 초음파 처리기에서 약 1시간 동안 용액을 초음파 처리한다.
초음파 처리가 끝나면 용액이 명확 해지고 용액이 여전히 혼탁 한 경우 추가 30 분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 지질 용액에서 30 밀리몰의 최종 농도로 초음파 처리 된 소포에 염화칼슘을 첨가하십시오. 마이크로 피펫 팁을 잘라 샘플 용액을 주입하여 구멍에 단단히 맞도록 합니다.
지질 용액을 혼합하고 이미징 챔버의 구멍 중 하나를 통해 주입합니다. 인접한 채널의 오염을 방지하기 위해 깨끗한 티슈로 배출구에서 챔버에서 나오는 과도한 용액을 닦으십시오. 50 밀리리터 원심 분리 튜브의 끝에 물티슈를 놓아 가습 챔버를 준비하십시오.
슬라이드를 튜브에 넣고 튜브 캡을 닫습니다. 튜브를 옆으로 눕히고 이 어셈블리를 가습 챔버에 90분 동안, 바람직하게는 섭씨 37도의 인큐베이터에 두십시오. 많은 양의 PBS 버퍼로 챔버를 철저히 세척하여 세척하는 동안 기포가 챔버로 들어가는 것을 방지하면 멤브레인에 결함이 발생할 수 있습니다.
이동성 및 조립에 대한 실험을 수행하기 전에 형광 비드 샘플을 준비하고 단일 비드의 형광 반점이 이미지에서 겹치지 않도록 저농도의 미세 유체 채널에 추가하여 TIRF 현미경을 정렬합니다. 먼저, 비드를 에피형광 모드로 시각화합니다. 조명이 에피형광 모드에 있는 동안 전체 내부 반사 구성이 달성될 때까지 대물렌즈에서 나오는 빔이 구부러지도록 병진 스테이지에 있는 M5 미러를 이동합니다.
TIR 조명이 달성되었는지 여부를 확인하기 위해, TIR 소멸 필드가 비드 샘플을 비추고 표면에서 떨어진 자유 플로팅 비드가 관찰되지 않을 때 표면의 비드만 보이는지 확인하십시오. 실험을 시작할 때 형광단의 광 파괴를 방지하기 위해 대물 렌즈 후면 초점면의 레이저 출력을 5-10밀리와트로 설정합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 맨 막에 초점을 맞추십시오. 먼저 지질막의 작은 불순물 흔적만으로도 막을 시각화하기에 충분합니다.
마이크로 피펫을 사용하여 샘플을 PEG SLB 코팅 이미징 챔버에 주입합니다. 단일 분자 결합 동역학을 측정하기 위해, 주사기 펌프를 사용하여 표지된 생체분자를 분당 50 내지 500 마이크로리터의 유속으로 입구 구멍을 통해 미세유체 챔버로 유동시킨다. 초당 25-50 프레임으로 5, 000 프레임을 녹화하려면 필요한 동영상 획득 매개 변수를 설정하십시오.
영화 획득을 시작하고 멤브레인 표면에 새로운 반점의 출현이 더 이상 증가하지 않을 때까지 주사기 펌프로부터 연속 흐름 하에서 5, 000 프레임 이상을 획득하고 원고에 설명 된대로 결합 동역학을 분석합니다. 단일 입자 추적을 위해 마이크로 피펫을 사용하여 저농도의 표지된 생체 분자를 채널에 추가합니다. 데이터 세트에서 복구된 트랙의 높은 충실도를 보장하려면 개별 입자가 경로를 거의 교차하지 않도록 평방 마이크로미터당 0.1개 입자 미만의 밀도로 농도를 최적화합니다.
필요한 경우 가습 환경에서 챔버를 배양하고 이미징하기 전에 버퍼로 세척합니다. 단일 입자 궤적 분석의 경우 초당 10-100 프레임으로 200-500 프레임을 획득하고 이미지 획득 중에 최소한의 스테이지 드리프트로 이중층 평면에 초점을 맞춘 대물 렌즈를 유지합니다. 서브유닛 측정을 위해 표지된 생체 분자의 관련 농도를 미세유체 이미징 챔버에 추가하고 필요한 시간 동안 원하는 온도의 가습 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.
이미징하기 전에 이미징 챔버를 버퍼로 세척하십시오. 슬라이드를 현미경에 놓고 초점을 조정하여 라벨링된 분자를 시각화합니다. 레이저 출력을 형광단의 표백이 점진적으로 발생하는 수준으로 설정하십시오.
이상적으로 조립된 각각의 복합체에 대해 레이저 파워를 제어하여 원고에 설명된 대로 10 내지 20 프레임 사이의 광표백 단계 속도를 유지하고, 모든 분자가 완전히 광표백될 때까지 이미지를 획득한다. 샘플이 챔버에 도입되는 즉시 동영상 획득을 시작하고 PEG SLB의 다른 세그먼트에서 막 결합 후 고정된 시간 간격으로 새로운 사진 표백 영상을 획득하여 시간 종속 어셈블리 측정을 수행합니다. 5 몰 퍼센트 DOPE-PEG (2000)의 지질 막에 대한 Cytolysin A의 결합은 증가 된 입자 밀도를 나타내고 포화를 달성했다.
결합 된 입자에 맞는 지수 붕괴 함수는 Cytolysin A 막 결합에 대한 시간 상수를 제공합니다. 멤브레인에 PEG 폴리머가 없으면 대부분의 추적자는 SLB에서 제한된 확산을 나타냈습니다. 멤브레인 이중층에서 소량의 PEG 2000이 기본 표면에서 들어 올려져 추적 분자가 표면 제약 없이 확산될 수 있습니다.
그러나, 이중층 막에서 PEG의 고농도에서 극단적 인 감금이 관찰된다. 2개의 상이한 PEG 2000 지질 막에서 친유성 DNA 추적자의 확산을 위한 ISD2 분포는 고농도의 PEG에서 감소된 이동성을 나타내었다. 붐비는 지질 이중층 막에서 배양 한 후 Cytolysin A는 많은 뚜렷한 사진 표백 단계를 보여 다양한 조립 중간체의 형성을 시사합니다.
표지 효율을 보정한 후, 올리고머의 최종 분포는 도데카메릭 Cytolysin A 종이 우성 구조임을 나타내었다. 막 단백질 결합 조립 및 기타 반응은 적절한 막 밀집 환경에서 수행되어야 합니다. 이미징 챔버를 청소하고, 이중층을 방해하지 않고, TIRF 현미경을 설정하는 데 주의를 기울여야 합니다.
