이 프로토콜을 사용하면 단일 분자 수준에서 제한 엔도뉴클레아제에 의한 부위 특이적 DNA 절단을 직접 관찰할 수 있습니다. 당사의 다중화 접근 방식을 통해 수백 개의 개별 REase가 촉매 주기를 완료하는 데 걸리는 시간을 측정할 수 있습니다. 멀티플렉싱을 사용하면 감마 확률 분포에 맞출 수 있는 잘 채워진 dwell time to cleavage 분포를 생성하여 DNA cleavage의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
먼저 50 마이크로리터의 올리고뉴클레오티드와 50 마이크로리터의 갓 준비된 DTT 용액에서 각 튜브에 재현탁 올리고뉴클레오티드에 대해 새로운 튜브를 준비하고 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 각 샘플 혼합물의 전체 부피를 준비된 컬럼과 750G에서 2분 동안 원심분리기에 부드럽게 피펫팅합니다. 원심분리 후에는 즉시 사용하지 않을 시료를 섭씨 20도에서 보관하여 티올기의 산화와 이황화물 결합의 형성을 방지합니다.
양자점 스톡 50마이크로리터의 부분 표본 1개를 투석 장치에 피펫팅하여 각 구조를 만들고 피펫 팁이 있는 멤브레인을 건드리지 않도록 합니다. 15 분 동안 100 분당 회전수에 약동을 가진 표본 양 의 적어도 1, 000 시간인 CHES 완충액의 양에 대하여 투석하십시오. 피펫터를 사용하여 투석 장치에서 부유 양자점을 조심스럽게 회수하고 새로 준비된 Sulfo-SMCC 용액이 동일한 부피의 새 튜브에 들어 있는 새 튜브로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
Sulfo-SMCC가 양자 점의 1 차 아민과 반응할 수 있도록 1, 000 RPM에서 동요를 가진 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 피펫터를 사용하여 각 샘플을 새 투석 장치로 조심스럽게 옮깁니다. 과잉 Sulfo-SMCC를 제거하기 위하여는, 15 분 동안 약동을 가진 투석 장치에서 포함된 양 의 적어도 1, 000 시간 인 CHES 완충액의 양에 대하여 투석하십시오.
완충액을 두 번 교환하고 새 CHES 완충액으로 총 세 번 투석을 수행하여 각 완충액 교환 후 15분 동안 투석을 진행할 수 있습니다. 그런 다음 PBS로 투석을 반복합니다. 피펫터를 사용하여 투석 장치에서 양자점이 포함된 용액을 조심스럽게 회수하고 각 샘플을 PBS에 희석된 등몰량의 팽창 올리고뉴클레오티드가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다.
1, 000 분당 회전수에 동요를 가진 실내 온도에 2 시간 동안 잠복하십시오. 최종 농도를 밀리리터당 0.5mg으로 하기 위해 각 샘플에 BSA를 첨가합니다. 그런 다음 피펫터를 사용하여 각 샘플을 조심스럽게 새 투석 장치로 옮기고 저장 완충액에 대해 투석합니다.
투석 후에는 각 검체를 조심스럽게 회수하여 새 튜브에 넣습니다. 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 양자점 표지된 올리고뉴클레오티드 샘플과 10배 초과량의 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 결합합니다.
열 블록의 혼합물을 섭씨 75도까지 가열하고 그 온도에서 5분 동안 유지합니다. 그런 다음 열 블록을 끄고 혼합물을 천천히 식히십시오. 완성된 구조물을 섭씨 4도에서 보관 테이퍼 다이아몬드 포인트 휠 비트가 장착된 휴대용 회전식 다중 도구를 사용하여 석영 슬라이드의 반대쪽 모서리에 두 개의 구멍을 뚫어 입구와 출구 역할을 합니다.
슬라이드를 제자리에 고정하고 비트에 윤활유를 바르고 드릴링하는 동안 물로 계속 미끄러지십시오. 각 실험이 끝나면 사용한 장치를 아세톤에 담가 접착제와 에폭시를 용해시켜 준비된 석영 슬라이드를 복구합니다. 나머지 구성 요소를 폐기합니다.
25 마이크로리터의 스트렙타비딘 용액을 80 마이크로리터의 PBS 및 20 마이크로리터의 차단 완충액과 결합합니다. PEG 처리된 커버 슬립에 이 혼합물을 코팅하고 습한 환경에서 30분 동안 배양합니다. 커버 슬립을 배양하는 동안 이미징 스페이서를 준비하여 흐름 채널을 생성합니다.
이미징 스페이서 재료의 1인치 정사각형 조각을 자른 다음 석영 슬라이드에 뚫린 구멍의 끝에 정렬된 2mm 너비의 채널을 표시합니다. 메스로 스페이서 재료에서 채널을 잘라냅니다. 석영 슬라이드를 아세톤으로 철저히 청소하여 이전 실험에서 남아 있는 접착제를 제거합니다.
이미지 스페이서에서 뒷면의 한쪽을 떼어내고 입구와 출구 구멍을 막지 않도록 주의하면서 석영 슬라이드에 조심스럽게 놓습니다. 커버 슬립을 물로 씻고 압축 공기로 건조시킵니다. 이미징 스페이서에서 뒷면의 다른 쪽을 제거하고 플라스틱 핀셋을 사용하여 석영 슬라이드와 기능성 스트렙타비딘 코팅 커버 슬립 사이에 끼워 어셈블리를 함께 누르고 접착제에서 기포를 제거합니다.
용액의 자유로운 흐름을 보장하기 위해 튜브의 끝을 비스듬히 자릅니다. 그런 다음 30cm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 석영 슬라이드의 각 구멍에 삽입합니다. 튜브 랙으로 튜브를 제자리에 고정한 다음 에폭시를 사용하여 튜브를 제자리에 밀봉하고 조립된 장치의 가장자리를 밀봉합니다.
에폭시가 굳으면 빈 주사기의 뭉툭한 바늘을 장치의 출구 튜브에 삽입하고 입구 튜브의 끝을 차단 완충액으로 채워진 용기에 담그십시오. 주사기 플런저를 뒤로 당겨 장치에 차단 완충액을 채웁니다. 그런 다음 사용하기 최소 30분 전에 장치를 배양하도록 두십시오.
미세유체 장치를 테이프로 현미경 스테이지 플레이트에 부착합니다. 대물렌즈를 장치 바닥에 접촉시키고 시야가 미세유체 채널 내에 있도록 대물렌즈를 배치합니다. 배출 튜브를 주사기 펌프에 연결한 후 주사기 플런저를 뒤로 당겨 새로운 차단 완충액으로 미세유체 채널을 세척합니다.
튜브나 채널에 기포가 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 제조된 DNA 기질 1마이크로리터를 1밀리리터의 차단 완충액으로 희석합니다. 입구 튜브를 희석된 DNA 기판에 넣고 분당 200마이크로리터의 속도로 채널을 통해 800마이크로리터의 기판 용액을 흘립니다.
흐름이 멈춘 후 15분 동안 DNA 용액이 채널에서 배양되도록 합니다. 배양 후 분당 200 마이크로리터의 속도로 채널을 통해 최소 800 마이크로리터의 차단 완충액을 흐르게 하여 결합되지 않은 DNA를 채널 밖으로 헹궈냅니다. 표면 테더링된 양자점이 명확하게 보이도록 현미경 초점을 조정합니다.
분당 200마이크로리터의 유속으로 마그네슘이 없는 800마이크로리터의 실험용 버퍼로 미세유체 장치를 플러시합니다. REase를 마그네슘이 없는 실험용 완충액의 부분 표본에 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 분당 200마이크로리터의 유속으로 EcoRV 밀리리터당 400단위의 800마이크로리터를 흐르게 합니다.
마그네슘과 플루오레세인이 포함된 실험용 완충액을 분당 200마이크로리터의 유속으로 흐르게 하여 실험을 시작합니다. 주사기 펌프를 시작한 직후 데이터 캡처를 시작합니다. 800 마이크로리터의 버퍼를 흘린 후 데이터 수집을 중지합니다.
DNA 기질을 플로우 셀에 도입하고 과도한 DNA와 양자점을 씻어낸 후에는 일반적으로 시야에 수천 개의 개별 양자점이 있습니다. 유리 표면에 안정적으로 부착되며 실험 전반에 걸쳐 눈에 띄는 디밍이나 심각한 표백이 발생하지 않습니다. 마그네슘이 없는 상태에서 REase가 채널을 통해 흐르면 실험 시작 시 존재하는 양자점의 최소 95%는 관찰 기간이 끝난 후에도 여전히 볼 수 있습니다.
그러나 REase 직후에 마그네슘 함유 완충액이 흐르면 관찰 기간이 끝날 때까지 양자점의 최대 절반이 사라지며, 이는 REase와 마그네슘이 함께 채널을 통해 흐를 때 관찰되는 것과 유사합니다. 양자점 소멸은 빠르게 발생하여 강도 궤적의 급격한 감소를 초래하여 주어진 DNA 분자가 절단되는 시간을 명확하게 표시합니다. 이 실험은 잘 연구된 유형 II P REase EcoRV로 수행되었습니다.
비선형 최소 제곱 곡선 피팅과 최대우도 매개변수 추정을 모두 사용하여 데이터에서 n과 beta의 값을 추출했습니다. 두 가지 매개 변수 추정 방법이 일치했습니다. 비선형 최소제곱 피팅을 사용하면 n은 3.52초, beta는 5.78초입니다.
최대우도 추정치를 사용하여 n은 3.41초, beta는 6.06초였습니다. 이 분석은 절단 경로를 따라 중간 단계가 존재한다는 증거를 제공할 수 있습니다. 변화하는 반응 조건에서 이 분석을 수행하면 직접 관찰할 수 없는 반응 중간체의 특성을 확립하는 데 도움이 될 수 있습니다.
