이 프로토콜은 Sf9 바쿨로바이러스 시스템을 사용하여 활성 분자 모터를 정제하는 간단한 방법을 제공합니다. 또한 운동 단백질의 조절 메커니즘을 연구하기 위한 단일 분자 운동성 및 다중 모터 글라이딩 분석에 대해 자세히 설명합니다. 기존의 모든 벡터 발현 Sf9 바쿨로바이러스 발현 및 단일 단계 친화성 정제는 순수하고 활동적인 운동 단백질을 이끌고 단일 분자 및 다중 모터 시스템에서 초공정 키네신의 기계론적 세부 사항을 연구할 것입니다.
Kinesin 모터 외에도 이 프로토콜을 적용하여 디오닌 및 미오신 같은 다른 세포골격계 단백질의 생화학적 및 생물물리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 프로토콜은 상세하고 따르기 쉽습니다. 몇 가지 제안은 Sf9 세포가 오염되기 쉽기 때문에 조심스럽게 다루고 프로토콜에 제공된 참고 사항을 따르는 것입니다.
시각적 시연은 매우 효과적이며, 특히 이러한 분석을 수행한 적이 없는 사람들에게 중요한 단계를 따르고 이해하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 Pushpanjali Soppina와 Dipeshwari Shewale, 나와 Pradeep Naik과 함께 일하는 박사 과정 학생입니다. 시작하려면 35 밀리리터 접시에 세포를 4.5 배의 밀도로 밀리리터 당 10-5 번째 세포로 씨를 뿌립니다.
24 시간 후, 1 마이크로 그램의 bacmid DNA와 100 마이크로 리터의 보충되지 않은 그레이스 배지를 튜브에 섞습니다. 다른 튜브에 6 마이크로 리터의 형질 주입 시약을 100 마이크로 리터의 보충되지 않은 Grace 's 배지와 혼합합니다. 첫 번째 튜브의 내용물을 두 번째 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
이들을 혼합하고 혼합물을 실온에서 45 분 동안 배양한다. 보충되지 않은 Grace 배지 0.8ml를 혼합물에 첨가하십시오. 셀에서 Sf900 SFM 배지를 혼합하고 흡인합니다.
준비된 형질주입 배지를 세포의 상부에 적가하고, 플레이트를 6시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 형질 주입 혼합물을 조심스럽게 제거하십시오. SF900 SFM 배지 2밀리리터를 넣고 섭씨 28도에서 48시간 동안 더 배양합니다.
다음으로, 도립 형광 현미경으로 운동 단백질 발현을 확인합니다. 감염된 세포로 배지를 수확하고 500G에서 5분 동안 회전합니다.상청액을 수집하고 분취량을 스냅 동결합니다. 멸균된 100밀리리터 원뿔형 플라스크에 세포가 있는 SF900 SFM 배지 10밀리리터와 P-제로 바이러스 스톡 1밀리리터를 추가합니다.
섭씨 28도에서 90rpm으로 일정하게 흔들면서 배양합니다. 72시간 후, 세포를 500G의 15밀리리터 멸균 원추형 튜브에서 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 수집한다. 대규모 단백질 발현의 경우, 30 밀리리터의 현탁액 배양을 1 밀리리터의 P1 스톡 바이러스로 감염시킵니다.
감염 후 72 시간, 단백질 발현을 위해 세포를 확인하고 멸균 된 50 밀리리터의 원추형 튜브에서 세포를 수집하십시오. 방사 후, 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 수집한다. 세포를 용해하려면 3 밀리리터의 얼음 냉 용해 완충액을 세포 펠릿에 첨가하십시오.
세포 용해물을 섭씨 4도에서 30 분 동안 150, 000G에서 회전시킵니다. 상청액을 수집하고 40 마이크로 리터의 50 % ANTI-FLAG M2 친화성 수지와 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 종단 간 텀블링과 함께 3시간 동안 배양합니다.
이제 섭씨 4도에서 1분 동안 500G에서 회전하여 FLAG 수지를 펠릿화합니다. FLAG 수지 펠릿을 얼음처럼 차가운 세척 완충액으로 세 번 세척합니다. 그리고 세 번째 세척 후 세척 버퍼를 조심스럽게 배출하십시오.
다음으로, 밀리리터 FLAG 펩티드 당 100 마이크로그램을 함유하는 70 마이크로리터의 세척 완충액을 수지 펠릿에 첨가하고, 앞에서 설명한 바와 같이 섭씨 4도에서 밤새 배양한다. 방사 후, 정제 된 단백질을 함유 한 상청액을 신선한 튜브에 모으십시오. 원고에 기재된 바와 같이 중합 혼합물을 제조하고, 중합 혼합물에 10 마이크로 리터의 튜 불린을 첨가한다.
튜브를 열 블록으로 옮기고 섭씨 37도에서 예열하고 30 분 동안 배양합니다. 미세소관 안정화 완충액을 준비한 후, 이를 가온하고, 중합된 미세소관에 첨가한다. 운동성 유동 세포 챔버가 준비되면, 30 마이크로리터의 희석된 미세소관 용액을 챔버를 통해 유동시킨다.
30분 후, 40 내지 50 마이크로리터의 블로킹 완충액을 흘려주고 이를 배양한다. 운동성 혼합물을 준비하고 정제 된 모터 1 마이크로 리터를 첨가하십시오. 잘 혼합하고 용액을 운동성 챔버로 흘립니다.
TIRF 조명 하에서 운동성 챔버와 이미지의 양쪽 끝을 밀봉합니다. 프로세스적으로 움직이는 개별 mCitirine 태그가 지정된 모터에 중점을 둡니다. 로다민으로 표지된 튜불린과 표지되지 않은 튜불린을 1:10의 비율로 혼합합니다.
중합 30분 후, 예열된 미세소관 안정화 완충액 30마이크로리터를 부드럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 추가로 배양한다. 모세관 로딩 팁으로 피펫팅하여 미세소관을 전단합니다. 운동성 유동 챔버를 준비한 후, 50 마이크로리터의 Sf9 정제된 GFP 나노바디를 흘려주고 30분 동안 배양한다.
50 마이크로리터의 블록 완충액을 흘려줌으로써 커버 슬립 표면을 차단한다. 50 마이크로 리터의 모터 믹스를 준비하십시오. 용액을 부드럽게 혼합한 후 챔버 내로 흐르게 하고 30분 동안 배양한다.
50 마이크로 리터의 P12- 카제인으로 챔버를 두 번 씻으십시오. 활공 분석 혼합물을 준비하고 운동성 챔버로 흐르기 전에 부드럽게 혼합하십시오. 운동성 챔버의 끝을 밀봉하고 TIRF 조명 하에서 활공하는 이미지 미세소관.
형질주입 48시간 후, 형질주입되지 않은 세포는 작고 둥글며 단단히 부착된 것처럼 보입니다. 그러나, 단백질을 발현하는 형질감염된 세포는, 표면에 느슨하게 부착되었고, 확대된 세포 직경을 보였다. 72 시간 후, Sf9 세포의 90 % 이상이 형광 태그, 키네신 -3 모터 KIF1A를 발현했으며 세포는 표면에 느슨하게 결합되었습니다.
키네신-3 운동 단백질을 형질감염된 Sf9 세포로부터 정제하였다. 키모 그래프는 미세 소관 표면을 따라 과정적으로 걷는 키네 신 -3 모터를 묘사합니다. 운동성 이벤트는 각각 초당 약 2.44 마이크로미터 및 10.79 마이크로미터의 평균 속도 및 실행 길이를 나타내었다.
키모그래프는 키네신-3 모터에 의한 부드러운 미세소관 활공을 나타내며 평균 속도는 초당 약 1.37마이크로미터입니다. 가장 중요한 것은 미세소관 혼합을 방해하지 않고 안정화 완충액을 추가하고 미세소관을 전단하지 않는 것입니다. 이 프로토콜은 ATPase 측정, 생물 물리학 적 분석, 메커니즘, 체외 재구성 분석 등과 같은 다른 응용 분야에 유용합니다.
sf9 정제 모터를 사용하여 최근에 kinesin-3 모터가 빠르고 초공정적이라는 것을 입증했습니다. 흥미롭게도 이러한 모터는 특성이 잘 지정된 모터인 Kinesin-1에 비해 높은 ATP 회전율을 나타냅니다.
