저자는 원고를 교정에 대 한 멩 팬을 감사 합니다. 이 작품은 지원에 의해 싱가포르 교육부의 교육 학술 연구 기금 계층 3 (MOE2012-T3-1-001) 재; Mechanobiology 연구소 싱가포르 재;를 통해 연구 재단 국립 연구 재단, 총리의 사무실, 싱가포르, 그것의 NRF Investigatorship 프로그램 (NRF Investigatorship 수상. NRF-NRFI2016-03 재; H. y 중앙 대학 (2017KFYXJJ153)에 대 한 근본적인 연구 기금.

1. 준비 G4 DNA의 단일 분자 기지개 <ol><li>준비 5 &#39;-thiol 분류 및 5 &#39;-biotin PCR 5를 사용 하 여 람다 파지 DNA 템플렛에 DDNA 중 합 효소를 사용 하 여 dsDNA 핸들 이라고 표시 된 &#39;-thiol 및 5 &#39;-비오 틴 뇌관 14 ( 그림 1). 두 dsDNA 처리는 높은 GC 내용 (&#62; 60%) DNA를 방지 하기 위해 녹는 때 DNA는 높은 힘에서 또는 DNA 잡아당기고 동안 전환 15.</li>
	<li>정화 PCR 제품 제조 업체에 따르면 BstXI 제한 효소로 다이제스트를 상업적인 정화 키트를 사용 하 여 &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>선 G4 형성 ssDNA, 그리고 측면 ssDNA 및 dsDNA 핸들 제조 업체에 따라 T4 DNA 리가 사용 하 여 &#39; s 프로토콜. 합자 제품 제조 업체에 따라 상업적인 정화 키트를 사용 하 여 젤 추출 하 여 정화 &#39; s 프로토콜.</li>
</ol> 2. 흐름 채널의 준비 <ol><li>Coverslip 청소 및 표면 기능화 <ol><li>장소 coverslips (#1.5, 22 × 32mm) 및 최고 coverslips (#1.5, 20 m m x 20 m m) (각 병 coverslips의 7 조각을 저장할 수 있는 항아리를 얼룩이 지는 커버 유리로 바닥 볼륨이 ~ 20 mL). 2-5 번 증류수와 함께 항아리에는 coverslips을 린스.</li>
		<li>추가 ~ 각 병, 그리고 30 분에 대 한 초음파 청소 목욕에서 다음 장소에 5-40% 세제 솔루션의 20 mL에 증류수로 씻어 &#62; 세제를 제거 하려면 10 번.</li>
		<li>건조 오븐에서 항아리에 coverslips (~ 150 ° C; 주의 핫), 또는 N 2 가스. 건조 장에서 말린된 최고 coverslips를 저장.</li>
		<li>청소 10 분 동안 항아리에 coverslips를 사용 하 여 플라즈마 (O 2 가스). 10 분 동안 준비의 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (항) 솔루션 메탄올 20 mL (주의 독성/물). 화학 증기 두건 항 메탄올 분해를 사용 하 여. 
		참고: 항 솔루션을 저장할 때 습도를 피하십시오. 오래 된 항은 종종 coverslips의 표면 functionalizing에서 문제 발생.</li>
		<li>플라즈마 청소, 직후 항아리에 모두 1% 항 솔루션을 추가 하 고 1 헤 부 1% 항 메탄올에 대 한 특정 폐기물 병으로 폐기물에 대 한 품 어. 가연성 화학 물질에 대 한 증기 두건에서 메탄올 관련 된 단계를 수행 하십시오.</li>
		<li>린스 한번 메탄올과 항아리와 &#62; 10 배와 증류수, 오븐 (~ 150 ° C;에 의해 다음 드라이 주의 뜨거운)입니다. 건조 캐비닛 아닐 경우 최대 2 주 동안 사용 항 코팅 아래쪽 coverslips를 저장. 
		참고: 각 하위 단계에서 2.1.1 2.1.4, 후 청소 과정 일시 중지할 수 있습니다 다음 단계 전에.</li>
	</ol></li> <li>어셈블 흐름 채널 <ol><li>두 준비 &#34; 스페이서 &#34;, 즉, parafilm 또는 더블 사이드 테이프 (~ 4 m m × 20 m m) 각 채널에 대 한. 긴 가장자리를 따라 아래쪽 coverslip에 스페이서의 두 조각을 놓으십시오. 최고 coverslip 형성 흐름 셀 사이 공백에 배치 (~ 10 mm × 20 m m 영역, 그림 2A , B).</li>
		<li>는 Parafilm으로 스페이서를 사용 하는 경우 위 흐름 채널 히터 (60-120 ° C; 주의 뜨거운) 부드럽게 parafilm으로 두 개의 coverslips 함께 붙어 최고 coverslip의 양쪽을 누르고 있는 동안 5-10 s. 결과 흐름 채널의 높이 ~ 100 µ m, 그리고 그로 인하여 채널의 볼륨 ~ 20 µ L.</li>
		<li>누설을 피하기 위해 실리콘 접착제로 채널의 긴 가장자리를 밀봉 하십시오. 실리콘 접착제를 사용 하 여 항목 및 솔루션의 출구로 흐름 채널의 각 열려있는 가장자리에 작은 싱크 같은 구조를 만들기 위해. 
		참고: 입구와 출구 만들 수 있습니다 예를 들어, 다른 방법으로 붙는 작은 플라스틱 반지 왁 스를 사용 하 여.</li>
		<li>최대 4 주 동안 건조 캐비닛에 채널 저장.</li>
	</ol></li> <li>흐름 채널의 하단 표면에 밧줄 DNA <ol><li>아미노산 코팅 된 폴리스 티 렌 구슬 희석 (직경: 3 µ m) 소 주 1 X 200 X 인산 염 (PBS) 버퍼 버퍼링. 소용돌이 구슬 솔루션 그리고 채널에 다음 흐름. 비드 솔루션에 대 한 채널에서 품 어 ~ 30 분 1 X PBS 버퍼의 200 µ L로 세척 하 여 어떤 떨어진된 구슬을 제거.</li>
		<li>조정 (증가/감소) 50 m m x 50 m m 영역 당 1-5 구슬의 표면 밀도 달성 하기 위해 부 화 시간이. 최대 3 일에 대 한 참조 구슬 입금 채널 저장.</li>
		<li>Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) 1 X PBS 솔루션으로 cyclohexane-1-카복실산 (Sulfo SMCC) 분말 (~ 0.5 mg/mL). 소용돌이 솔루션 및 채널에 다음 흐름. 
		참고: 사용 하기 전에 신선한 Sulfo SMCC 솔루션을 준비 하 고는 SMCC hydrolyzation 피하기 위해 채널에 그것을 즉시 추가.</li>
		<li>품 SMCC 솔루션 30 분에 대 한 채널에서 다량으로 세척 하 여 SMCC 솔루션 제거 (1 mL, ~ 50 채널 볼륨 X) 1 X PBS 솔루션. 
		참고: 초과 SMCC 신중 하 게 씻어. 이 단계는 coverslip에 DNA의 바인딩을 위해 매우 필수적 이다.</li>
		<li><ol><li>DNA tethering 희석의 결과 DNA 농도와 1 X PBS에 DNA 라는 thiol biotin ~ 0.3 nM. 부드럽게 혼합 하는 솔루션, 흐름 DNA 솔루션 SMCC 코팅 채널에 고 실 온에서 30 분 동안 품 어 플라스틱 (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>부드럽게 씻어 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 0.01 %2-Mercaptoethanol 1 X PBS를 포함 하는 솔루션을 차단의 200 µ L와 함께 무료 DNA.</li>
		<li>차단 채널 표면 솔루션 (10 mg/mL BSA, 0.01 %2-Mercaptoethanol) 차단에 채널을 배양 하 여 &#62; h;이 단계 후 2 채널은 실험에 대 한 준비. 준비 된 채널 4 ° C에서 보관 하실 수 있습니다 ~ 1 일. 
		참고: 블로킹 단계는 DNA와는 coverslips 자석 구슬의 비 특정 바인딩을 줄이기 위한 중요.</li>
	</ol></li></ol> 3. 마그네틱 핀셋 설치 및 단일 식별 dsDNA 밧줄 <ol><li>자석 족집게 설치 <ol><li>시작 자석 족집게 제어 프로그램. 여기, 자석 족집게에 집을 작성 된 LabVIEW 프로그램에 의해 통제 되었다.</li>
		<li>채널을 탑재 하기 전에 자석 센터를 맞춥니다. 렌즈를 4 X를 사용 하 여 조정는 x-축 및 y 축 현미경의 광 축에 자석의.</li>
		<li>컴퓨터 제어 전동된 조작 기를 사용 하 여 z-방향 ( 그림 2A) 따라 자석 이동 거리 d로 설정을 = 0 (d: 자석 coverslip 사이의 거리)는 자석을 연결 하는 경우 현미경에 coverslip.</li>
		<li>프로그램 (즉, 상수 d) 지속적인 힘을 포함 하 여 힘의 제어를 달성 하기 위해 조작 통해 자석의 움직임 및 F (t)를 강제로 시간 변화 (즉, 시간 변화 d(t )).</li>
		<li>목표 통해 구슬의 다시 흩어져 조명을 위한 밝은 발광 다이오드 (LED) 광원 사용. 여 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라. 100 Hz의 샘플링 레이트에서 구슬 이미지 수집 < /l나 ></ol></li> <li>샘플을 설치 하 고 단일 dsDNA 밧줄 식별 <ol><li>밧줄 형성 <ol><li>부드럽게 200 X 흐름 분석 솔루션 (100 m m KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4에에서 M-280, 상자성 구슬 희석 )는 채널에. 구슬 thiol 표시 끝 통해 SMCC 코팅 표면에 움직일 biotin 표시 된 DNA 분자에 바인딩할 수 있도록 10 분 동안 품 어. 부드럽게 씻어 표준 반응 솔루션의 200 µ L를 사용 하 여 취소 닿는 구슬. 
			참고: M-280 구슬 표시 M-270 같은 다른 상업 자석 구슬을에 비해 표면에 더 낮은 일반적인 바인딩.</li>
		</ol></li> <li>현미경 무대에 채널을 탑재. 기름 침수 목표 X 100을 사용 하 여 바닥 표면에 구슬에 대 한 검색.</li>
		<li>참조 구슬 표면에 및 이동 테더 구슬 선택합니다. 참조 구슬과 다른 defocus 비행기에 닿는 구슬의 초기 이미지 라이브러리 구축.</li>
		<li>구슬 이미지의 보정 <ol><li>실험 전에 사용 하 여 객관적인 압 전 액츄에이터 참조와 두 개의 별도 비드 이미지로 저장 되는 20-50 nm, 의해 다른 defocus 비행기에 닿는 구슬의 이미지 라이브러리와는 각각 defocus 거리 ( 그림 2D) 색인.</li>
		</ol></li> <li>x, y, z 위치 결정 <ol><li>실험, 동안 구슬 중심에 의해 x-y 평면에서 구슬의 위치를 결정. 라이브러리에 저장 된 현재 구슬 이미지를 비교 하 여 닿는 구슬의 높이 변화를 확인 합니다. 구슬 이미지 16의 푸리에 변환의 파워 스펙트럼의 자동 상관 함수 분석 사용.</li>
		</ol></li> <li>안티 드리프트 피드백 참조 비드를 사용 하 여 <ol><li>실험 동안에 피를 사용 하 여 &#34; 잠금 &#34; 목표와 낮은 주파수를 통해 라이브러리에 저장 된 특정 참조 구슬 이미지 사이의 거리 피드백 제어, 걸린된 구슬 이미지 ( 그림 2D) 라이브러리에 저장 된 특정 이미지와 가장 상관 관계는.</li>
		</ol></li> <li>는 밧줄을 적용 하 여 단일 dsDNA 분자 인지 확인 ~ 65 pN 포스는 밧줄 전환 17 ,를 잡아당기고 특성 DNA 경우 단일 dsDNA 분자 결정 18 , 19. 단일 dsDNA 밧줄을 찾을 때까지 과정을 반복. (강제로 교정 및 전환 잡아당기고 DNA에 대 한 다음 섹션을 참고 하십시오).</li>
	</ol></li></ol> 4. 마그네틱 핀셋 강제로 교정 <ol><li>직접 통해 비드 동요를 사용 하 여 긴 DNA (48,502 bp λ-DNA) 분자 힘 (최대 100 pN) 결정: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg" /> , 여기서 k B는 볼츠만 상수, T는 켈빈 규모에서 온도, δ 2 y 구슬 변동 자기장 및 힘에 수직 방향으로 분산 방향입니다. 이 방향에서는, 구슬의 모션 l + r 0, 어디 l DNA의 힘 방향 (확장)에 따라 엔드-투-엔드 거리 이며 r 0의 길이 가진 진 자 변동으로 기술 될 수 있다 구슬 10 ( 그림 3A)의 반지름.</li>
	<li>결정 자석 구슬 거리의 기능으로 힘 F에 대 한 교정 커브 d, 그리고 F (d) 긴 λ-DNA를 사용 하 여 다른 구슬에 대 한. 일반적으로, 자석과 coverslip 사이의 거리는 사용 DNA 밧줄 길이 무시 될 수 있습니다. 맞게 F-이중 지 수 감퇴 기능에 d 커브: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg" /> , 어디 피팅 매개 변수 α1, α2, γ1, γ2에 의해 결정 됩니다는 마그네틱 족집게와 매개 변수 C 자석 구슬의 다른 유형의 속성에 의해 결정 됩니다. C, F를 이동 하 여-d 곡선 다른 구슬에서 얻은 겹쳐 10 ( 그림 3B) 될 수 있습니다.</li>
	<li>짧은 DNA에 대 한 개별 자성 구슬에 대 한 매개 변수 C의 교정 실험.
	<ol><li>코너 주파수 보다 높은 주파수에서 구슬 위치 기록 요구는 변동에 따라 힘을 결정: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg" /> γ 끌기가, 구슬의 계수입니다. 높은 힘에 짧은 DNA에 대 한 100 Hz 보다 더 빨리 녹음 주파수를 요구 한다, 따라서, 힘 없는 직접 측정 변동에 따라 카메라와 함께. 그러나 C 낮은 것에 힘을 측정 하 여 결정 될 수 있다 매개 변수 범위를 강제 하는, (&#60; 15 pN) 동요를 사용 하 여 및 피팅 데이터 보정 F-d 매개 변수 C 20를 곡선.</li>
		<li>또는 dsDNA 실험, 결정 매개 변수 C의 힘에 과도 잡아당기고 DNA를 사용 하 여 ~ 65 pN ( 그림 3C) 21 , 22 , 23는 dsDNA 보였다 확장 점프 (0.6 X 윤곽선 길이 길이 증가)에서 d 위치를 기록 하 여. 매개 변수 C를 결정 한 후 테더 구슬에 대 한 힘을 산출 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>F (d)의 역 기능을 통해 자석의 움직임을 프로그래밍 하 여 로딩 속도 제어. 자석 더블 샘플 기 하 급수적으로 접근 해야 합니다. 
	참고: 이러한 추정 방법 결정 하는 힘의 상대 오차는 ~ 10%, 구슬 반경이 20에 의해 주로 발생 하는 고.</li>
</ol> 5. 단일 분자 조작 g 4의 존재와 부재의 바인딩 단백질 <ol><li>0.2 pN/s 뒤의 로딩 속도에 힘 증가 검색 수행 힘 램프 실험 <ol><li>dsDNA 밧줄을 확인 후에 -0.2에서 강제로 사망 스캔 pN/s. 각 스트레칭 주기 후 30 1 pN에서 DNA 분자를 잡고 G4 refold를 ssDNA 있도록 s.</li>
	</ol></li> <li>포스 점프 실험 <ol><li>30 54 pN 사이 힘 주기 s는 접힌된 G4 접힌, 수 고는 접힌된 G4-15T refold 수 60 대 1 pN.</li>
	</ol></li> <li>흘러 내린 단백질 해결책 <ol><li>흐름 단백질 해결책에서 때 ~ 하는 coverslip 구슬의 첨부 파일을 피하기 위해 20 pN 힘. G4 구조에 높은 특이성을 보여주었다, DEAH 상자 RHAU helicase 사용된 24 했다. 초파리 melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase 재조합 대장균에 표현 하 고 앞에서 설명한 25 정화 했다. DmRHAU의 풀기 활동 tetramolecular G4 DNA 기판 13에 분석 되었다 G4.</li>
	</ol></li> <li>Matlab 프로그램 14 작성 한 사내를 사용 하 여 전개 힘 분석.</li></ol>

<ol>
	<li>Rhodes, D., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+their+regulatory+roles+in+biology.">G-quadruplexes and their regulatory roles in biology.</a> Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).</li><li>Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+quadruplex-binding+proteins.">DNA and RNA quadruplex-binding proteins.</a> Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).</li><li>Gonzalez, V., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+nucleolin+promotes+the+formation+of+the+c-MYC+G-quadruplex+and+inhibits+c-MYC+promoter+activity.">The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity.</a> Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=telomerase-interacting+protein+that+unfolds+telomere+G-quadruplex+and+promotes+telomere+extension+in+mammalian+cells.">telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).</li><li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+helicases.">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li><li>Schiavone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+Is+Required+for+Replicative+Tolerance+of+G+Quadruplexes+in+Vertebrate+Cells.">PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells.</a> Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).</li><li>Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+G-quadruplex+structures.">Stability and kinetics of G-quadruplex structures.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).</li><li>Woodside, M. T., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+folding+energy+landscapes+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy.</a> Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+high-force+magnetic+tweezers+for+stretching+and+refolding+of+proteins+and+short+DNA.">Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA.</a> Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+equilibrium+folding+and+unfolding+transitions+of+titin+immunoglobulin+domain+under+constant+forces.">Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces.</a> J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).</li><li>You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+c-MYC+promoter+G-quadruplexes+studied+by+single-molecule+manipulation.">Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation.</a> J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).</li><li>You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RHAU+helicase+stabilizes+G4+in+its+nucleotide-free+state+and+destabilizes+G4+upon+ATP+hydrolysis.">RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).</li><li>You, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+stability+of+polymorphic+human+telomeric+G-quadruplex+under+tension.">Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension.</a> Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).</li><li>Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+states.">Two distinct overstretched DNA states.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA.">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Fu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates.">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li><li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA.">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+magnetic+tweezers.">Recent advances in magnetic tweezers.</a> Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).</li><li>Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules.">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).</li><li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies.">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).</li><li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets.">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li><li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes:+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome.">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li><li>Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+G-quadruplexes+in+gene+promoters:+a+novel+anticancer+strategy?.">Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).</li><li>Amato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+Development+of+Specific+G-Quadruplex+Binders:+Synthesis,+Biophysical,+and+Biological+Studies+of+New+Hydrazone+Derivatives.">Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives.</a> J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).</li><li>Wells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-B+DNA+conformations,+mutagenesis+and+disease.">Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease.</a> Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).</li></ol>

저자는 공개 없다.

G4 DNA의 기계적 안정성을 공부 하 고 g 4를 사용 하 여 단백질의 상호 작용을 위한 플랫폼 위에서 설명한 대로 단일 분자 자석 족집게 보고 됩니다. 플랫폼을 동반, G4 DNA 밧줄, 그리고 접는 전개 역학의 측정과 나노미터 특별 한 해상도와 G4 구조의 안정성을 찾는 매우 효율적인 프로토콜 개발 된다. 초점면 잠그기를 통해 g 4 같은 작은 구조 전환이 감지에 대 한 중요 한 매우 안정적인 안티 드리프트 ?...

4 가닥 DNA 또는 RNA G4 구조는 많은 중요 한 생물 학적 과정1에서 중요 한 역할을 재생합니다. 많은 단백질 g 4 바인딩 및 telomere 바인딩 단백질 (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)를 포함 한 규제에 관련 된1,2, 녹음 방송 요인 (nucleolin, PARP1)3, RNA 단백질 (hnRNP A1, 처리 A2 hnRNP)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5, 그리고 DNA 복제 관련 단백질 (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. 단백질 바인딩 수 안정 또는 불안정 G4 구조; 따라서 후속 생물학적 기능을 규제. G 4의 안정성 자외선 (UV) 또는 원형이 색 성 (CD) 방법7을 사용 하 여 용 해 열 측정 했다. 그러나, 이러한 상태는 생리 관련 바인딩 단백질7의 효과 공부 하 고 적용 하기가 어렵습니다.
단일 분자 조작 기술에 급속 한 발전은 폴딩 및 실시간8나노미터 분해능으로 단일 분자 수준에서 단백질, DNA 등 biomolecule의 전개의 연구를 활성화 하 고. 원자 힘 현미경 (AFM), 광학 족집게 및 자석 족집게는 가장 일반적으로 사용 되는 단일 분자 조작 방법. AFM와 광학 핀셋9에 비해, 자석 족집게 반 드리프트 기술을10,11을 사용 하 여 단일 분자의 폴딩 전개 역학의 안정적인 측정을 일 동안 수 있습니다.
여기, 단백질에 바인딩하여 G4 안정성의 규칙을 공부 자석 족집게를 사용 하 여 단일 분자 조작 플랫폼 보고12,13입니다. 이 작품 샘플 및 흐름 채널 준비, 자석 족집게의 설치 힘 보정 등 기본 접근법을 설명 합니다. 힘 제어 및 안티 드리프트 프로토콜에 설명 된 단계 3으로 일정 한 힘 (힘 클램프) 등의 다양 한 포스 컨트롤에서 긴 시간 측정에 대 한 허용 하 고 상수 로드 (포스-램프), 속도 및 힘-점프 측정. 단계 4에서에서 설명한 힘 교정 프로토콜의 힘 보정 가능 &#60; 넓은 힘에 짧은 밧줄 1 µ m 범위 10% 내에서 상대적인 오류와 함께 최대 100 pN. RNA Helicase의 안정성의 규칙의 예를 들어 RNA G413이 플랫폼 응용 프로그램을 설명 하는 해결에 필수적인 역할을 재생 하는 누구나 풍부한 요소 (RHAU) helicase (별칭 DHX36, G4R1)와 관련 된.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA PCR primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>DNA preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA PCR chemicals</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>DNA preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>restriction enzyme BstXI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0113S</td>
			<td>DNA preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)</td>
			<td>BMH.BIOMEDIA</td>
			<td>72204</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon90</td>
			<td>Decon Laboratories Limited</td>
			<td></td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-500ML</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-280, paramganetic beads,streptavidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Amino Microspheres 3.00 &#956;m</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>17145-5</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-250ML</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscopes IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo-Z Stages P-721</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPLAPON-Oil 100X</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD/CMOS camera</td>
			<td>AVT</td>
			<td>Pike F-032B</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation linear stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>MoCo DC</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubic Magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro/Matlab</td>
			<td>OriginLab/MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers

비 정식 핵 산 보조 구조 G-quadruplexes (G4) DNA 복제, 전사, RNA 가공, 및 telomere 신장 하 여 다양 한 세포질 프로세스에서 포함 된다. 이 프로세스 동안 다양 한 단백질 바인딩 하 고 그들의 기능을 수행 하도록 G4 구조를 해결 합니다. G 4의 함수는 종종 접힌 구조의 안정성에 따라 달라 집니다, 그것은 G4 바인딩 단백질 g 4의 안정성을 조절 하는 방법을 조사 하는 것이 중요. 이 작품 실시간으로 단일 G4 분자에 G4 바인딩 단백질의 레 귤 레이 션의 연구를 가능 하 게 자석 족집게를 사용 하 여 단일 G4 분자를 조작 하는 메서드를 제공 합니다. 일반적으로이 메서드는 상호 작용 단백질/ligands 및 다양 한 DNA 또는 RNA 이차 구조 규정에 대 한 연구에 응용 프로그램의 넓은 범위에 적합 합니다.

단일 G4 분자 스트레칭을 위한 실험 설정 그림 4에 표시 됩니다. 두 dsDNA 핸들 사이의 스팬 단일 가닥 G4 형성 시퀀스는 coverslip 상자성 구슬 사이 곁에 했다. 단일 dsDNA 테더 비드를 찾으려면 overstretching 분석 결과 일정 로딩 속도로 힘을 증가 하 여 수행 되었다. 세 가지 유형의 측정 접는 공부 하 고 생체의 전개를 위해 자주 사용 했다: (i) 지속적인 힘 측...

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K 조회수.  Huazhong University of Science and Technology. 단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

연구

생화학

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately 20 nm to accommodate large tRNA substrates at the A-, P- and E-sites. Consequently, the ribosome dynamics are naturally de-phased quickly. Single molecule method can detect each ribosome separately and distinguish inhomogeneous populations, which is essential to reveal the complicated mechanisms of multi-component systems. We report the details of a smFRET method based on the Nikon Ti2 inverted microscope to probe the ribosome dynamics between the ribosomal protein L27 and tRNAs. The L27 is labeled at its unique Cys 53 position and reconstituted into a ribosome that is engineered to lack L27. The tRNA is labeled at its elbow region. As the tRNA moves to different locations inside the ribosome during the elongation cycle, such as pre- and post- translocation, the FRET efficiencies and dynamics exhibit differences, which have suggested multiple subpopulations. These subpopulations are not detectable by ensemble methods. The TIRF-based smFRET microscope is built on a manual or motorized inverted microscope, with home-built laser illumination. The ribosome samples are purified by ultracentrifugation, loaded into a home-built multi-channel sample cell and then illuminated via an evanescent laser field. The reflection laser spot can be used to achieve feedback control of perfect focus. The fluorescence signals are separated by a motorized filter-turret and collected by two digital CMOS cameras. The intensities are retrieved via the NIS-Elements software.

Single molecule fluorescence energy transfer is a method that tracks the tRNA dynamics during ribosomal protein synthesis. By tracking individual ribosomes, inhomogeneous populations are identified, which shed light on mechanisms. This method can be used to track biological conformational changes in general to reveal dynamic-function relationships in many other complexed biosystems. Single molecule methods can observe non-rate limiting steps and low-populated key intermediates, which are not accessible by conventional ensemble methods due to the average effect.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...