저자는 부분적으로 촬영하는 동안 그녀의 도움을 셰필드 씨 Jaimee 메인이 대학이 연구를 호스팅하는 데에 대한 여행 자금 지원을위한 NanoVentures 호주와 교수 존 헤이 콕을 인정하고 싶습니다.

1. 금 NR을 준비 참고 : 금 NR을 조리법 (16)의 숫자에 의해 합성 또는 상업적 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. <ol><li> UV-비스 분광법을 통해, 0.5 nm의 해상도에서 300 내지 1000 nm가 내지 흡수 값을 기록함으로써 금 NR 용액의 초기 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 용액의 부피는 큐벳 가능한 함께 사용하도록 다양하다. </li><li> 적합한 기술 (17)의 초기 NP 몰 농도 (예를 들어 UV-비스 분광법, 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법, 투과형 전자 현미경)을 평가하거나 공급 업체에서 제공하는 농도 값을 사용한다. </li><li> 가장 재현성 OD = 1 도달 테스트 샘플의 모든 OD를 일정하게 유지하기 위해 초기의 Au NR 샘플을 희석하여 5 ㎖ 스톡 용액을 준비한다. 희석 용매의 조성에 대한 상용 공급 업체의 프로토콜을 따르십시오. 잘 모르는 경우탈 이온수를 사용합니다. </li><li> 두 번 15 분 동안 금 NR 용액 1 ml의 7,800 XG에 원심 분리기는 솔루션에서 어떤 화학 초과를 제거합니다. 원심 분리 사이클 힘과 시간 (예를 들면 20 분에서 5600 ×의 g) 18 다를 수 있습니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 탈 이온수 NR을 다시 일시 중지합니다. 재 부유 입자가 용액에 응집체를 형성 할 수 있듯이, 최상의 결과를 가지고 매일을 준비. 또한, 1 주 이상 더 이상을위한 냉장고에 보관. 냉동하지 마십시오. </li><li> 세포 배양 조건에서 사용하기 전에, 5 분 동안의 Au NR 용액을 초음파 처리 한 다음 (MW가 m을 ∙하게는 400보다 -2 254 nm에서 UV 방사 강도)을 30 분 동안 UV 광으로 소독. </li></ol> 2. NG108-15 신경 세포 라인 문화와 차별화 <ol><li> 세포 배양 배지를 들어, 멸균 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 소 태아 혈청 (/ V w) (FCS) 10 %를 함유하는 1 % (w / v)의 L 글루타민, 1 % 500㎖를 준비(w / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 0.5 % (w / v)의 암포 테리 신 B를 주 : 보조제는 -20 ° C에서 저장, 분주 필요한 날에 배지에 첨가 할 수있다. 세포 배양 배지는 1 개월 최대 무균 상태로 냉각 될 수있다. </li><li> 세포 분화 배지를 들어, 1 %를 함유하는 멸균 된 50 ㎖의 DMEM을 준비 L 글루타민, 1 % (w / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.5 % (w / v)의 암포 테리 B. (/ V w) </li><li> (37 ° C에서 5 % CO 2) 가습 분위기 인큐베이터 폴리스티렌 T75 플라스크에 세포 배양 배지 10ml에 NG108-15 신경 세포 성장. 일반적으로 3-4 일 내에 준비 될 각 플라스크에 1.5 × 105 세포를 시드. 이틀 세포 배양 배지를 변경합니다. 참고 : 실험로 (21)보다 오래된 세포를 사용하지 않는, 유전 드리프트 또는 변화를 방지하기 위해. </li><li> 때 70~80% 합류는 문화, 따뜻한 신선한 세포 배양 매체 매체를 변경합니다. 기계적 공사 부드럽게하여 세포를 분리왕 합류 플라스크의 바닥. 트립신을 사용하지 마십시오. </li><li> 원심 분리기 (600)와 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 다시 일시 따뜻한 세포 분화 배지 2 ㎖로 세포를 펠릿. </li><li> 세포 분화 배지 200㎕를 가진 조직 배양 96 웰 폴리스티렌 플레이트에 씨앗 2 × 104 세포 / ㎠. 5 % CO 37분의 2 ℃에서 1 일 동안 실험을 품어. </li><li> 2 일에 금 NR 용액 10 0 1 × -4.2 9 10 × 3.2 사이의 입자 / ㎖를 추가하고 추가로 24 시간 동안 그것을 품어. 제어 실험에 입자를 추가하지 마십시오. 주의 : 다른 컨트롤로서 잘 분화 흡수 극대 파장의 Au NPS는 비교 목적 14에 사용될 수있다. 보다 일관된 셀 동작을 위해서 (때문에)는, 일정한 세포 밀도를 유지하고 세포 파종하기 전에 잘 표면을 수정하지 마십시오. </li></ol> 3. 신경 돌기 성 향상 <ol><li> 한 쌍단일 모드 광섬유와 레이저 (개구 = 0.13)와 (FC 커넥터는 편리하고 일반적으로 사용할 수있는) 섬유 커넥터를 종료합니다. 표준 전력 측정기와 출력 레이저 파워를 측정한다. 가장 효과적인 결과를 얻기 위해서는 각 NR 플라즈몬 공진 레이저 피크의 피크 파장을 일치 시키. </li><li> 3 일 다음 NR 배양에서 잘에 FC 커넥터를 고정합니다. 다른 레이저 파워를 들어, 연속 파형에서 1 분 동안 실온에서 샘플 및 컨트롤을 조사. 문화가 5 % CO 37분의 2 ℃에서 추가로 3 일 동안 할 수있게합니다. 세 독립적 인 측정의 최소 레이저 조사를 반복한다. 주의 : 다른 조사 시간 및 펄스 주파수는 응용에 따라 선택 될 수있다. </li><li> 빔 직경과 레이저 방사의 관점에서 레이저를 특성화 (W ∙ cm -2). <ol><li> 표준 단일 모드 광섬유를 들어, NA = N ∙ 죄 θ를 사용n은 사용되는 매질의 굴절률이고, θ는 출사 광 섬유의 원뿔의 반각이다 (도 1a 참조). R은 빔 반경 삼각법, R = θ ∙ 황갈색 D 및 D에서 섬유와 샘플 사이의 거리이다. FC 커넥터는 따라서 거리 (d)에서 샘플 = 2.70 ± 0.20 mm를 조명 잘의 직경과 일치합니다. 빛, R = 황갈색 (SIN-1 (NA / N))를 제공하는 d의 ∙ (N = 1.33)을 물에 섬유를 종료합니다. </li><li> 후자의 방정식을 사용하여, 레이저 빔 반경 대응 빔 영역과 대상에 평균 레이저 조사량 (빔 면적으로 나눈 레이저 파워)를 계산 (도 1b에 예시 그래프를 참조). 이러한 값은 조명 된 영역에 걸쳐 평균 조도를 나타낸다. </li><li> 에러 전파의 일반 이론과 측정 오류를 평가합니다. 참고 : 거리 B를etween FC 커넥터와 샘플은 적절한 소프트웨어 (예 ImageJ에)를 사용하여 화상의 실험 장치와 후 처리의 사진으로 측정 할 수있다. </li></ol></li><li> 5 일째, 실험에서 세포 분화 배지를 제거하고 3.7 %를 10 분 동안 (V / V) 포름 알데히드 용액으로 샘플을 고정하고, 0.1 내지 20 분간 (v / v) 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> (/ V W) 60 분 동안 샘플을 소 혈청 알부민 (BSA)에 결합 부위 반응을 차단하는 단백질의 3 %를 추가한다. 4 ° C에서 안티 βIII - tubulin의 하룻밤 (PBS에서 / ㎖ 5 μg의이 BSA의 1 %로 보충)에 대한 샘플을 레이블. </li><li> PBS에 1 % BSA에서 0.4-2 ㎍ / ml의 농도를 사용하여 (예 TRITC 공액 항 - 마우스 IgG 항체) 적절한 이차 항체로 어두운 90 분 동안 세포를 배양한다. 10 분 동안 DAPI (0.1 ㎍ / ㎖의에 탈 이온수)와 세포 핵 레이블. 참고 : 항체 활용과 농도 미그를HT는 회사의 프로토콜에 따라 다릅니다. 두 번 각각의 염색 단계 후 5 분 동안 PBS로 세척 샘플. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li> 적어도 20 × 목표를 사용하여 표면 형광 또는 공 초점 현미경으로 이미지 샘플. 현미경은 이차 항체에 따라서 필터를 선택. DAPI 필터 선택 (λ EX = 358 nm의, λ EM은 488 나노 미터 =) 세포 핵을 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 평가함으로써 이미지 분석 : ⅰ) 최대 신경 돌기 길이 (기록 전지 본체의 시작 신경 돌기의 선단까지의 길이)를, ⅱ) 신경 세포 당 신경 돌기의 수 ()는 셀당 신경 돌기를 모두 합산 및 III) 신경 돌기를 가진 세포의 백분율 (적극적으로 핵 염색 세포의 총 수) 19 튜 불린 - βIII을 발현하는 세포의 총 수를 나눈다. </li></ol> 4. 세포 내 칼슘 이미징 레이저 유도 <ol&gt; <li> 플루로 닉 F-127 스톡 용액 (/ V w)을 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 10ml에 용질 2g을 용해시켜 20 %를 준비한다. 용해도를 증가시키기 위해 약 20 분 동안 40 ° C에서의 플루로 닉 F-127 용액을 가열한다. RT에 저장된 사전에 준비를합니다. </li><li> NR 배양 한 다음 3 일에서 균형 염 용액 준비 (BSS 135 mM의 NaCl을, 4.5 mM의 KCl을, 1.5 mM의 염화칼슘 2, 0.5 mM의의 MgCl 2, 5.6 mM의 혈당, 10 mM의 HEPES, 산도 7.4), 5로 보충 DMSO의 FLUO-4 AM 및 0.1 %의 μM (W / V)로 닉 F-127 솔루션. 주 : BSS 용액을 미리 제조하고, 1 개월 최대 냉각 될 수있다. 실험의 날에 보충 (FLUO-4 오전 플루 F-127)를 추가합니다. </li><li> 세포 분화 배지를 제거하고 BSS 보충 용액으로 교체한다. 반전 공 초점 현미경으로 최상의 결과를 얻으려면 잘 마이크로 슬라이드에 세포를 배양한다. </li><li> FLUO-오전 4시 넣 NG108-15 세포5 % CO 37분의 2 ° C에서 어둠 속에서 30 분. 배양 시간에 따라, 어떤 세포 외 언로드 형광 물질을 제거하는 BSS로 두 번 샘플을 씻는다. </li><li> 몇 단일 모드 광섬유 레이저와 함께 표준 기술을 사용하여 팁을 절단. (팁은 현미경 검사시 섬유 축에 수직 인 평면이어야 IE) 고품질 표면을 보장하기 위해, 광학 현미경으로 관찰 결과 팁. <ol><li> 표준 전력 측정기와 출력 레이저 파워를 측정한다. 광섬유 홀더로 빛을 전달 섬유를 삽입하고 마이크로 포지셔너에 부착합니다. 브라운 등의 알을 참조하십시오. (20) 광섬유 준비와 위치에 대한 자세한 내용은. 주의 : (예 : 레이저 광선을 직접 보지 않는다 처리하는 동안 레이저 안전 고글을 착용, 다른 실험실 사용자에게 미광 노출을 방지) 레이저 파워의 측정하는 동안 레이저 안전에 대한 일반적인 규칙을 따르 &lt;./ 리&gt; </ol></li><li> 광 변조를 모니터링하는 휴대용 레이저에 오실로스코프를 연결합니다. 가변 주파수 (0.5 Hz에서) 및 펄스 길이 (20 ~ 100 밀리 초)와 이진 신호를 사용합니다. Paviolo 등.도 13에 도시 된 설치 다음, 현미경 트랜지스터 - 트랜지스터 논리 (TTL)와 같은 변조 된 신호를 입력하여 레이저를 연결한다. <ol><li> 반전 된 공 초점 현미경으로 세포를두고 떨어져 투과 조명 모드에서 타겟 셀로부터 광 전달 섬유 250 ± 50 ㎛의 위치. 이 거리에서, 타겟에 빔 반경을 계산하도록 3.3.1에 ​​제시된 방정식을 사용한다. </li></ol></li><li> 내면화 FLUO-4 오전 염료를 자극하기 위해 아르곤 이온 레이저 (488 nm의)를 사용 (λ EX = 494 nm의, λ EM 516 나노 미터 =)와 endocytosed NR을의 여기에 대한 동기화 LD를. 시계열 스캔을 수집함으로써, 적어도 40 × 대물를 이용한 샘플 및 컨트롤 RT에서 촬상을 수행256 × 256 픽셀 / 최소 4 Hz의 주파수 왕복 모드에서 프레임 해상도. 임의의 아르곤 이온 레이저 간섭 (잡음 기준)을 식별하는 임의의 LD 여기없이 기록이 행해진. </li><li> 적응 적 가중치 범 최소 제곱 알고리즘 (21)을 사용하여 데이터로부터 배경을 제거한다. 시간의 함수로서 유도 된 칼슘의 변화를 플롯. 레벨 기준선 잡음 (3​​σ)의 표준 편차의 3 배를 임계 화함으로써 영상 후 처리 소프트웨어를 사용하여 형광 강도 과도 피크를 분석한다. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subacute+and+chronic+toxicity+of+cetyltrimethylammonium+bromide+(CTAB),+a+cationic+surfactant,+in+the+rat.">The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat.</a> Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: synthesis, characterization and applications.</a> Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+golden+age:+gold+nanoparticles+for+biomedicine.">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+photothermal+therapy+(PPTT)+using+gold+nanoparticles.">Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles.</a> Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).</li><li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons.">TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).</li><li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent+rearrangement+of+TRPV4+cytosolic+tails+enables+channel+activation+by+physiological+stimuli.">Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), (2012).</li><li>Roggan, A., Friebel, M., D&#246;rschel, K., Hahn, A., M&#252;ller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm.">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=810+nm+wavelength+light:+an+effective+therapy+for+transected+or+contused+rat+spinal+cord.">810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord.</a> Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li><li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures:+involvement+of+reactive+oxygen+species.">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li><li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase.">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li><li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver:+a+theoretical+and+practical+approach.">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

이 프레젠테이션에서 설명하는 프로토콜은 문화, 차별화 광학적으로 외부 흡수를 사용하여 신경 세포를 자극하는 방법에 대해 설명합니다. NR 특성 (예를 들어 치수, 형상, 플라즈몬 공진 파장 및 표면 화학) 및 (등과 파장, 펄스 길이, 반복율, 등)의 레이저 자극 파라미터는 다른 실험의 필요에 맞도록 변화 될 수있다. 세포 행동에 영향은 표준 분석 및 생물학적 물질을 사용하여 모니?...

최근 연구에 따르면, 물 (파장&gt; 1400 ㎚)에 의해 외광의 흡수와 관련된 과도 가열 한 신경 조직 및 심장 근세포의 세포 내 칼슘이 과도에서 활동 전위를 유도하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 적외선 빛의 사용으로 인해 잠재적 인 미세한 공간 해상도로, 신경 보철에 응용 프로그램에 대한 큰 관심을 제기, 유전자에 직접 조직과 접촉, 자극 유물의 최소화 및 필요성을 제거 부족 (자극하기 전에 세포를 수정 ) optogenetics에 필요 하나. 이러한 모든 장점에도 불구하고, 최근에 개발 된 열 모델은 상기 대상 조직 / 세포 자극 여러 사이트 및 / 또는 고 반복율은 3,4- 사용되는 누적 가열 효과에 의해 영향을받을 수 있음을 제시 하였다. 이러한 과제에 대응하여, 연구자들은 외인성 absor를 사용할 수있는 가능성을 인식하고신경 자극에 대한 조직의 BER이 더 국부 가열 효과를 생성한다. 황 등. 원격 무선 주파수 자계 5 HEK 293 세포에서 온도에 민감한 TRPV1 채널을 활성화하기 위해 페라이트 초상 자성 나노 입자를 사용하여이 원리를 설명했다. 이 기술은 (자기장이 조직에 상대적으로 약한 상호 작용) 더 깊은 침투를 허용 할 수 있지만, 반응은 오히려 생체 공학 장치 (5)에 필요한 밀리 초 지속 시간보다, 초 기간에 걸쳐 기록되었다. 체외에서 검은 마이크로 입자를 쥐의 대뇌 피질 신경 세포의 유사, 파라 등. 입증 전기 자극. 이들은 잠재적으로 더 빠르게 반복 속도 6을 허용 μJ 범위의 에너지와 μS 수백 정도의 펄스 지속 시간을 사용하여 자극 세포 수준의 정밀도를 나타냈다. 외인성 흡수제의 사용은 또한 유도 적용된체외에서 형태 학적 변화. Ciofani 외는. (7)에 의해 여기 된 초음파 압전 질화 붕소 나노 튜브를 사용하여 신경 세포의 생장 ~ 40 %의 증가를 보였다. 마찬가지로, PC12 세포에서 endocytosed 산화철 나노 입자 인해 산화철 8 세포 접착 분자의 활성화, 용량 의존적으로 분화 신경 돌기를 향상시키기 위해보고되었다. 최근, 신경 자극을 지원하기 위해 외부 흡수에 대한 관심은 금 나노 입자의 사용 (금 NP에)에 초점을 맞추고있다. NPS는 효율적으로 AU 플라즈몬 피크에서의 레이저 광을 흡수하는 열 (9)의 형태로 주위 환경으로 방출 할 수있는 능력을 가지고있다. 10 - 가능한 입자 모양의 모든 사이에 금 나노 막대의 광 흡수 (금 NR을)를 편리하게 (NIR, 750-1,400 나노 미터 사이의 파장 적외선 근처) 생체 조직의 치료 창을 일치합니다. 또한, 계속에서신경 자극의 EXT는, Au로 각 NR 사용은 비교적 양호한 생체 적합성 및 표면 기능화 옵션 (11)의 넓은 범위를 제공한다. 최근의 연구 분화에 자극 효과가 NG108-15 신경 세포 12 금 NR을 지속적으로 레이저 노출 후 유도 될 수 있음을 보여 주었다. 마찬가지로, 세포 내 칼슘 과도 가변 주파수 및 펄스 변조 된 레이저 조사 13 길이 Au을 NR을 배양 신경 세포에서 기록되었다. 세포막 탈분극은 나선 신경절 신경 세포 (14)의 차 문화 금 각 NR NIR 레이저 조명 후에 기록되었다. 조사 금 NR을 가진 생체 응용 프로그램의 첫 번째는 최근에 증명되었다. 엄 동료는 플라즈몬 절정에 금 NR을 노출하고 복합 신경 활동 전위 (CNAPs)의 진폭의 6 배 증가 쥐의 좌골 신경의 자극 임계 값의 3 배 감소를 기록했다. 엉진일보 응답은 NR 플라즈몬 피크 (15)의 여기에 의한 발열 효과 지역에 기인 하였다. 본 논문에서는 금 NR을 배양 NG108-15 신경 세포에 레이저 자극의 효과를 조사하는 프로토콜이 지정됩니다. 이러한 방법은 표준 생물학적 기술 및 재료를 사용하여 시험 관내에서 세포 집단을 조사하는 간단하지만 강력한 방법을 제공한다. 프로토콜은 안전하게 작동하고 반복 가능한 정렬을 가능 광섬유 결합 형 레이저 다이오드 (LD)에 기초한다. 금 NR 샘플 준비 및 레이저 조사 방법에있어서, 상기 특정 프로토콜 합성 및 배양을 각각 제공하는 것으로 알려져있다, 다른 입자 형상 및 신경 세포 배양에 확장 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Au NR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716812</td><td></td></tr><tr><td>NG108-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8811230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Life Technologies</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5393</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Varian Medical Systems Inc.</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Mini Spin</td><td></td></tr><tr><td>Sonic bath</td><td>Unisonics Australia</td><td>FPX 10D</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Kendro</td><td>Hera Cell 150</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotofix 32A</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Optotech</td><td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td><td></td></tr><tr><td>Optical fiber</td><td>Thorlabs</td><td>780 HP</td><td></td></tr><tr><td>Power meter</td><td>Coherent</td><td>Laser Check</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Axon Instruments</td><td>ImageX-press 5000A</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-slide well</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td><td>LSM 510 meta-confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS210</td><td></td></tr></tbody></table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

여기에 설명 된 프로토콜 1, 2 및 3을 사용하여 분화에 자극 효과의 Au NP에 배양 NG108-15 신경 세포에서 관찰되었다 레이저 후에 (금 NR을, 폴리 (스티렌)의 Au NR을 실리카 코팅 된 금 각 NR을 코팅 처리) 1.25 및 7.5 W 사이의 노출 · cm -2. rhodamineB 표지 금 NR을 공 촛점 이미지는 입자가 배양 12 일 1 내면화되었다는 것을 보여 주었다. 지역화 주로 흡수 바람직한기구는 전지 본체 (12)를</sup...

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Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K 조회수.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

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Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

뉴런의 사진 자극에 저렴한 LED 배열을 사용하여

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

연구

신경과학

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

향상된 신경 화학적 검출을 위한 금 나노입자 수정 탄소 섬유 마이크로 전극

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

화학

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

생체공학

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

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The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

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Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

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실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

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