상대습도 미국 (R01HL116546 및 R01 AR064241) 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다.

이 프로토콜에 사용 되는 동물의 오하이오 주립 대학 실험실 동물 자원에서 동물 사용 지침에 따라 유지 되었다. 모든 동물 연구 기관 동물 관리, 사용, 및 오하이오 주립 대학의 검토 위원회에 의해 승인 했다.
1. 디자인 및 CRISPR 벡터에 gRNAs의 복제
<ol><li>SaCas9에 대 한 dystrophin intron 20과 intron 23 (i20 및 i23)를 대상으로 하는 2 gRNAs 선택: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 및 i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM 시퀀스는 밑줄을 표시 하 고 이탤릭체). 참고: i20 i23에 대 한 대상 사이트는 약 23 킬로 기본적인 쌍 (kbp) 멀리. 코딩 유전자 중단, 두 gRNAs NNGRRT 팸 일반적인 exons를 대상으로 SaCas9에 대 한 시퀀스 (선호 NNGAAT, NNGGGT 및 NNGAGT) 및 20 kbp 이내 거리는 것이 좋습니다.</li>
	<li>버퍼를 어 닐 링 x 1에서 다음 PCR 매개 변수 anneal gRNA oligos (100 µ / L)를 사용 (버퍼 재고를 어 닐 링 x 5 0.5 mol/L K-아세테이트, 150 mmol/L HEPES 포함-코, 10 mmol/L Mg-아세테이트, pH7.4): 95 ° C 10 분 당 0.4 ° c 95 ~ 59 ° C의 90 주기 감소 20 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 59 ~ 32 ° C의 90 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 32에 26 ° C의 20 주기 s.</li>
	<li>pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA로 단련된 gRNA oligos를 위하여 BsaI와 T4 DNA 리가 한 반응에 사용 하 여 (1 µ L 50 ng / µ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µ L 단련 oligos, 1.5 µ L 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 0.5 µ L T4 DNA 리가, 1 µ L BsaI, 10 µ L ddH2O ), PCR cycler에서 다음 반응 조건: 5 주기 [37 ° C 5 분 및 16 ° C 10 분]; 37 ° C 20 분; 80 ° C 5 분입니다.</li>
	<li>15 µ L 결 찰 제품을 30 µ L 유능한 세포 변환, 100 µ g/mL 암 피 실린, 한 천 판에 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화 셀 접시.</li>
	<li>5-10 식민지와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c, 250 rpm 3-4 h 흔드는 인큐베이터에 들어 있는 LB 매체 문화를 선택 합니다.</li>
	<li>PCR에 의해 식민지 화면: 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스, 8 µ L ddH2O, 1 µ L 대장균 문화, 1 µ L 10 µ / L U6-앞으로 뇌관, 1 µ L i20 또는 i23 gRNA 역 뇌관. PCR 자전거 매개 변수: 95 ° C 5 분, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 초, 72 ° C 30 s의 35 주기.</li>
	<li>추가 4 mL 신선한 파운드 중간 containing100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 250 rpm에서 하룻밤 문화에 의해 긍정적인 클론의 5 mL 문화를 준비 합니다.</li>
	<li>적절 한 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 DNA 플라스 미드 정화 하 고 생어에 의해 플라스 미드를 확인 시퀀싱 U6-앞으로 뇌관.</li>
	<li>10 %FBS 1% 보충 DMEM C2C12 셀 문화 펜-Strep 유전자는 플라스 미드의 효능 편집 테스트용 ~ 70 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>Electroporate 5 µ g 1 x 106 C2C12 셀 제조업체의 프로토콜에 따라 1:1 어 금 니 비율에서 SaCas9/gRNA 플라스 미드 혼합물의 총.</li>
	<li>48 h 후 transfection 후 C2C12 세포를 수확 하 고 게놈 DNA를 추출 합니다.</li>
	<li>사용 100 ng genomic DNA 템플릿으로 마우스 dystrophin 로커 스에 대 한 PCR 반응을 수행 하: 전달 뇌관 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ L 10 µ / L), 반전 뇌관 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ L 10 µ / L), 10 µ L 2 녹색 PCR x 마스터 믹스, 7 µ L ddH2O, 1 µ L genomic DNA ( 100 ng). PCR를 사용 하 여 순환 조건 95 ° c 5 분, [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s]의 35 주기 72 ° C 2 분.</li>
</ol>2입니다. rAAV 생산
<ol><li>셀 문화, 15 cm의 20 ~ 40에 AD293 셀 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 보완 유지 펜-Strep transfection 대 ~ 90 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>200 µ L로 희석 3 플라스 미드 감소 (접시) 당 혈 청 매체: 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 또는 다른 serotypes) 및 3) pX601-i20, pX601 i23 혼합물 (1:1 비율)의 5 µ g의 총. 80 µ L 페이와 혼합 하 여 polyethylenimine (페이) transfection를 수행 하 고 dropwise 방식에서 10 분 추가 AD293 세포 배양에 혼합물에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>AAV 바이러스 생산, 72 h 게시물 transfection 후 10 분 동안 1100 x g에서 원심 분리 하 여 미디어와 AD293 셀 알 약을 수집 하 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다.</li>
	<li>액체 질소와 42 ° C 물 탕에서 보육 교류 3 freeze-thaw 주기 다음 15 mL rAAV 세포의 용 해 버퍼 (50 mmol/L 트리 스 베이스, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5)에 셀 펠 릿 resuspend 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우 미래 처리를 위한-80 ° C에 세포 lysates를 저장 합니다.</li>
	<li>0.45 μ m 필터와 문화 미디어를 필터링 하 고 추가 40% PEG8000 2.5 mol/L NaCl에에서 8%의 최종 농도. 1 시간에 4 ° C에 혼합물 그리고 15 분 동안 1100 x g에서 원심 분리기를 품 어.</li>
	<li>RAAV 세포의 용 해 버퍼에 산 탄을 resuspend 하 고 단계 2.3, 뒤에 1 시간 동안 37 ° C에서 benzonase (50 U/mL) 치료에서에서 세포 lysates 결합.</li>
	<li>원심 benzonase 처리 rAAV 혼합물 1100 x g 4 ° C에서 15 분을 포함 하 고 상쾌한 (원유 rAAV 준비)를 저장 합니다.</li>
</ol>3. rAAV 정화 및 농도
<ol><li>하단에는 다음 순서에 따라 ultracentrifuge 튜브에 iodixanol 그라데이션에 원유 rAAV 준비 위에서 로드: 원유 AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 %Iodixanol, 6 mL 25 %Iodixanol, 5 mL 40 %Iodixanol, 5 mL 58 %Iodixanol. 1 x DPBS를 사용 하 여 정상에 튜브의 나머지 빈 볼륨을 작성 합니다.</li>
	<li>230000 x g 10 ° C에서 120 분 ultracentrifuge로 터에서에 샘플 원심을 3-4 mL 18 G 바늘 rAAV 입자를 포함 하는 40% 그라데이션 분수의를 수집 합니다.</li>
	<li>1 x DPBS와 원심 분리기는 원심 필터 장치 (MWCO 100 kDa)를 사용 하 여 rAAV 입자를 희석. 대 한이 단계를 반복 3-5 시간 및 마지막으로 300-500 µ L rAAV 준비 집중.</li>
</ol>4입니다. rAAV Titering
<ol><li>2 µ L 집중 rAAV, 에탄올에 3 M NaOAc와 20 µ L ddH2O. resuspend 촉진에서 게놈 DNA를 추출</li>
	<li>PX601 플라스 미드의 직렬 희석에 의해 rAAV 정량에 대 한 표준 곡선을 얻기: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 각 10 µ L ddH2O. Dilute DNAase 치료 rAAV 1 x 105 부 샘플 1:10, 1시 50분, 1: 100, 그리고 1:1000.</li>
	<li>실시간 PCR 시스템에서 제조업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실시간 양이 많은 PCR (정량)에 의해 rAAV titer 결정: 1 µ L 10 µ / L 각 뇌관의 (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC 및 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ L PCR 마스터 믹스, 희석 1 µ L x 2 rAAV 샘플 및 2 µ L ddH2O. 자전거 매개 변수가 반응 실행: 95 ° C 3 분, 45의 주기 [95 ° C 5 초 61 ° C 20 초].</li>
</ol>5. 정 맥 및 복 rAAVrh.74-CRISPR 신생아 mdx/utrophin/- 생쥐에 주입
<ol><li>1 분 동안 얼음에 배치 하 여 mdx/utrophin+ 마우스 새끼 (3 일)를 immobilize 하 고 1 x 1012 복고풍 궤도 접근 또는 복 주사를 통해 체계적으로 마우스 당 50 µ L에서 바이러스 성 입자와 관리.</li>
	<li>복구 하 고 다시 자신의 집 새를 마우스 수 있습니다. RAAV 관리 후 10 주, 조직 컬렉션에 대 한 공동2 노출에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>스냅-동결 genomic DNA와 RNA 추출 및 사용 isopentane 최적의 절삭 온도와 조직 cryosectioning 복합 동결 액체 질소에 냉각에 대 한 조직.</li>
</ol>6입니다. 결과 편집 대상 유전자의 분석
<ol><li>
게놈 DNA PCR 분석
	<ol>
<li>Mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 조직에서 게놈 DNA 치료 또는 rAAV 없이 총을 격리 합니다.</li>
		<li>1.12 단계에서에서 동일한 프로토콜을 사용 하 여 PCR 분석에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dystrophin 식의 RT-PCR 분석
	<ol>
<li>제조업체의 설명서에 따라 RNA 추출 키트와 함께 심장 조직에서 총 RNA를 추출.</li>
		<li>반전 녹음 방송을 수행 하려면 미리 RNase 무료 DNase와 총 RNA를 치료 하 고 템플릿으로 처리 RNA의 5 µ g를 사용 하 여 반전 녹음 방송 장비를 가진 첫번째 물가 cDNA 합성에 대 한.</li>
		<li>반전 녹음 방송 제품을 사용 하 여 dystrophin cDNA 뇌관으로 dystrophin 식의 RT-PCR 분석: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 및 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량 분석에 의해 효능을 편집 하는 유전자 예측
	<ol>
<li>양적 RT-PCR exon 22 포함 된 성적 (exon 21) 앞으로 뇌관을 사용 하 여 감소를 감지 하 여 효능을 편집 하는 유전자 예측: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, 그리고 역방향 뇌관 (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. 앞으로 뇌관 참조 유전자로 Gapdh 사용: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC 및 역방향 뇌관: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>양이 많은 실시간 PCR (정량) 실시간 PCR 시스템과 2 단계 반응 조건에서 제조 업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실행: 95 ° C 3 분, 95 ° C 5 sec와 61 ° C 30 초 45 주기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 형광 분석 dystrophin 식 얼룩
	<ol>
<li>잘라 냉동된 조직 두께 10 µ m. 수정에는 cryostat를 사용 하 여 15 분 동안 실 온에서 4 %paraformaldehyde 냉동된 섹션.</li>
		<li>PBS로 2 배를 세척 하 고 1 시간에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청) 차단으로 품 어.</li>
		<li>안티 dystrophin 기본 항 체, 4 ° C 하룻밤에 품 어.</li>
		<li>PBS와 슬라이드를 씻어 3 × 5 분 및 1 시간에 대 한 실 온에서 형광 이차 항 체 (1: 500)를 품 어.</li>
		<li>DAPI를 장착 매체를 사용 하 여 거꾸로 confocal 현미경으로 이미징 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 오프 대상 분석 T7E1 분석 결과
<ol><li>온라인 CRISPR를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 사이트 디자인 도구와 같은 예측 < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>게놈 지역 취재는 상위 5-10 잠재적인 대상 오프 사이트 PCR에 의해 증폭: genomic DNA 200, 1 µ L 고 충실도 DNA 중 합 효소, 5 µ L 10 x PCR 버퍼 믹스, 1.5 µ L 10와 50 µ L 총 볼륨 조정 사이트별 정방향 및 역방향 뇌관의 µ / L ddH2o.</li>
	<li>전기 이동 법으로 PCR 제품을 실행 하 고 추출 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 광을 사용 하 여 농도 측정 합니다.</li>
	<li>변성 시키기 및 다시 사용 하 여 PCR cycler 버퍼 2.1에서 천천히 정화 amplicons 어 닐 링에 의해 heteroduplex 형성을 촉진 합니다. 동일한 자전거 상태를 사용 하 여 단계 1.2에서에서 상술 된 대로.</li>
	<li>0.5 µ L T7E1 효소, 37 ° C에서 30 분 동안 다시 단련된 제품을 소화 하 고 사용 하 여 1-2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 반응 분석. 참고:는 amplicons 또한 타겟된 깊은 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice.">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery.">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates.">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li><li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases.">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li></ol>

관심의 없습니다 충돌 존재합니다.

이 프로토콜에서 우리 vivo 심장 유전자 SaCas9 및 2 개의 gRNAs의 납품 rAAVrh.74 중재를 사용 하 여 출생 후 생쥐에서 편집을 달성 하는 데 필요한 모든 단계를 상세하게. 이전 지적,이 이렇게 dystrophic 쥐에서 dystrophin 식27의 우리의 작업 설명 된 대로 복원 사용할 수 있지만 그것은 또한 급속 한 반전 유전학 연구의 긴 과정 없이 쥐 심장 관련 유전자의 활성화 수는 생성 하 고 사육...

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술 게놈 엔지니어링에서 가장 최근의 발전을 나타내고 세포와 유기 체 유전학의 현재 연습을 혁명을. CRISPR 관련 된 단백질 (Cas9) 9 등 CRISPR 관련 endonuclease 직접 단일 가이드 RNA (gRNA)을 이용 한다 CRISPR 기반 게놈 편집 하 고는 protospacer 시퀀스에 보완은 genomic DNA 대상에 Cpf1와 gRNA에 의해 인코딩 한 특정 protospacer 인접 한 모티브 (PAM)1,2. PAM은 Cas9 또는 Cpf1 유전자의 세균성 종에 따라 다릅니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 파생 된 가장 일반적으로 사용 되 Cas9 nuclease NGG 비 대상 가닥에 genomic DNA에서 직접 대상 시퀀스의 다운스트림 발견 되는 팸 시퀀스를 인식 합니다. 대상 사이트에 Cas9 및 Cpf1 단백질 생성 등 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 상 동 감독 수리 (HDR) 경로3내장 세포 DNA 수리 메커니즘을 통해 복구 다음, 이중 가닥 휴식 (DSB) 4. 동종 재결합에 대 한 DNA 템플렛의 부재, DSB는 주로 수리 삽입 또는 삭제 (indels)에서 발생할 수 있는 오류가 NHEJ 통로 DSB 코딩에서 만들어진 경우 frameshift 돌연변이 일으키는 뉴클레오티드의 6유전자5,지역. 따라서, CRISPR 시스템은 널리 사용 되었습니다 다양 한 휴대폰 모델 및 전체 유기 체에 있는 손실의 기능 돌연변이 하는 유전자의 기능을 조사 하기 위하여. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 및 Cpf1 transcriptionally를 개발 되었습니다 그리고 epigenetically 조절 대상 유전자7,8의 표현.
더 최근에, SpCas9 및 SaCas9 ( 황색 포도상구균에서 파생 됨)는 패키지 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 벡터 인간 질환의 동물 모델에서 출생 후 유전자 교정용으로 특히, 듀 켄 씨 근 위축 증 (DMD)9,10,11,12,13,,1415. DMD는 치명적인 X 연결 된 열성 질병 dystrophin 단백질16,17인코딩하는 DMD 유전자에 있는 돌연변이 기인한 신생아 심사18 에 따르면 약 3500에서 한 남성 출생에 영향을 미치는 , 19. 진보적인 근육 약점 그리고 낭비 특징 이다. DMD 환자는 일반적으로 20-30 년20의 나이 10 ~ 12 세 사이의 호흡기 또는 심장 실패의 다이 걸을 기능 손실. 특히, 심근에 개발 > DMD 환자와 나타냅니다 DMD 환자21,22에 죽음의 주요 원인의 90%. 비록 Deflazacort (항 염증 약물) 및 Eteplirsen (는 엑손 exon 51를 건너뛰는 데 약을 건너뛰는) 최근 승인 된 DMD에 대 한 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)23,24, 이러한 치료의 게놈 DNA 수준에서 유전적 결함을 수정 합니다. Exon 23 dystrophin 유전자의 점 돌연변이 운반, mdx 마우스 DMD 모델25로 널리 사용 되었습니다. 또한, 우리 이전 기능 dystrophin 식 취재 exons 21, 22, 23 일 근육 광고-SpCas9/gRNA 배달9 사용 하 여 mdx 쥐의 골격 근육에서 게놈 DNA의 프레임 삭제에 의해 복원 된 시연 , 그리고 정 맥 및 복 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 배달26를 사용 하 여 mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 근육에.
이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 출생 후 심장 유전자 dystrophin mdx/utrophin/- 생쥐 dystrophin 분석 심장 근육 섹션에 gRNA 디자인에서 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 벡터를 사용 하 여 복원 하려면 편집 모든 단계.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio Safety Cabinets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Series A2 Class II, Type A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>Competent cells</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, 150mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Dystrophin antibody</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit, 0.45&amp;mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>High-speed plasmid mini kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Water Bath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Heat Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 instrument</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Instrument II</td></tr><tr><td>Large Capacity Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometers</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&amp;trade; 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligos for i20-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgGGCGT&lt;br/&gt;TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligos for i20-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>Oligos for i23-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgCACCGATGAGAGGG&lt;br/&gt;AAAGGTC</td></tr><tr><td>Oligos for i23-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Seal centrifuge tube</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>Type 70Ti</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Ultra centrifugal filter unit</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

adeno-associated virus-mediated delivery of crispr for cardiac gene editing in mice

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복 (CRISPR) 시스템은 크게 배양된 세포에 다양 한 종의 생물 게놈 엔지니어링을 촉진 했다. CRISPR 기술 또한 인간의 질병의 숫자에 대 한 새로운 치료제로 탐험 되었습니다. 개념 증명 데이터는 매우 고무적인 타당성과 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) murine 모델을 사용 하 여에 대 한 편집 기반 치료 방법은 유전자의 효능을 설명 하는 최근 학문에 의해 exemplified입니다. 특히, 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74)의 정 맥 및 복 주사 (SaCas9) 포도 상 구 균 CRISPR 관련 단백질 9의 효율적인 심장 배달 및 2 있었습니다. exon 23 마우스 Dmd 유전자에에서 돌연변이 codon 게놈 영역을 삭제 하려면 RNAs (gRNA) 안내. 이 같은 방법은 유전자의 관심 밖으로 노크 하는 gRNA 유전자의 코딩 지구를 대상으로 설계는 출생 후 마우스에 그들의 심장 기능을 공부도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 표시 rAAVrh.74 CRISPR 벡터 하는 방법 및 신생아 쥐에 고효율 심장 납품을 달성 하는 방법.

대상 게놈 DNA 영역 삭제를 유도 하는 gRNAs의 효능 vivo에서 학문을 위한 rAAV로 포장 하기 전에 셀 문화에서 평가 되어야 한다. 이 위해, gRNAs 및 SaCas9을 표현 구문 electroporated C2C12 세포로 되었고 대상 사이트 (그림 1) 측면 뇌관으로 PCR에 의해 게놈 DNA 분석. PCR 제품 ~ 500 bp 대상 게놈 DNA 유전자 제어 세포 게놈 DNA의 큰 크기로 인해 밴드 양보 하지 해야 하는...

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Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K 조회수.  Ohio State University Wexner Medical Center. 여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

비디오: Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

연구

유전학

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

암 연구학

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

Genome editing technology is widely used to produce genetically modified animals, including rats. Cytoplasmic or pronuclear injection of DNA repair templates and CRISPR-Cas reagents is the most common delivery method into embryos. However, this type of micromanipulation necessitates access to specialized equipment, is laborious, and requires a certain level of technical skill. Moreover, microinjection techniques often result in lower embryo survival due to the mechanical stress on the embryo. In this protocol, we developed an optimized method to deliver large DNA repair templates to work in conjunction with CRISPR-Cas9 genome editing without the need for microinjection. This protocol combines AAV-mediated DNA delivery of single-stranded DNA donor templates along with the delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) by electroporation to modify 2-cell embryos. Using this novel strategy, we have successfully produced targeted knock-in rat models carrying insertion of DNA sequences from 1.2 to 3.0 kb in size with efficiencies between 42% and 90%.

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation

This protocol presents an optimized approach for producing genetically modified rat models. Adeno-associated virus (AAV) is used to deliver a DNA repair template, and electroporation is used to deliver CRISPR-Cas9 reagents to complete the genome editing process in 2-cell embryo.

아데노 관련 바이러스(AAV) 및 2세포 배아 전기천공법을 이용한 쥐 배아의 CRISPR-Cas9 게놈 편집

Genome editing technology is widely used to produce genetically modified animals, including rats. Cytoplasmic or pronuclear injection of DNA repair ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

발생학

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

The CRISPR/Cas9 system offers the potential to make targeted genome editing accessible and affordable to the scientific community. This protocol is intended to demonstrate how to create viruses that will knockout a gene of interest using the CRISPR/Cas9 system, and then inject them stereotaxically into the adult mouse brain.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

신경과학

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

면역학 및 감염병학

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

생물학

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological phenomena. Zebrafish have been used as an effective genetic model to study numerous questions related to heritable disease, development, and toxicology at the whole-organ and -organism level. Due to the well-annotated and mapped zebrafish genome, numerous tools for gene editing have been developed. However, the efficacy of generating and ease of detecting precise knock-in edits using CRISPR is a limiting factor. Described here is a CRISPR-Cas9-based knock-in approach with the simple detection of precise edits in a gene responsible for cardiac repolarization and associated with the electrical disorder, Long QT Syndrome (LQTS). This two-single-guide RNA (sgRNA) approach excises and replaces the target sequence and links a genetically encoded reporter gene. The utility of this approach is demonstrated by describing non-invasive phenotypic measurements of cardiac electrical function in wild-type and gene-edited zebrafish larvae. This approach enables the efficient study of disease-associated variants in a whole organism. Furthermore, this strategy offers possibilities for the insertion of exogenous sequences of choice, such as reporter genes, orthologs, or gene editors.

This protocol describes an approach to facilitate precise knock-in edits in zebrafish embryos using CRISPR-Cas9 technology. A phenotyping pipeline is presented to demonstrate the applicability of these techniques to model a Long QT Syndrome-associated gene variant.

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive molecules. The creation of BAT-specific knockout mice is one of the most popular approaches for understanding the contribution of a gene of interest to BAT-mediated energy regulation. The conventional gene targeting strategy utilizing the Cre-LoxP system has been the principal approach to generate tissue-specific knockout mice. However, this approach is time-consuming and tedious. Here, we describe a protocol for the rapid and efficient knockout of a gene of interest in BAT using a combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and adeno-associated virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. The interscapular BAT is located in the deep layer between the muscles. Thus, the BAT must be exposed in order to inject the AAV precisely and directly into the BAT within the visual field. Appropriate surgical handling is crucial to prevent damage to the sympathetic nerves and vessels, such as the Sultzer's vein that connects to the BAT. To minimize tissue damage, there is a critical need to understand the three-dimensional anatomical location of the BAT and the surgical skills required in the technical steps. This protocol highlights the key technical procedures, including the design of sgRNAs targeting the gene of interest, the preparation of AAV-sgRNA particles, and the surgery for the direct microinjection of AAV into both BAT lobes for generating BAT-specific knockout mice, which can be broadly applied to study the biological functions of genes in BAT.

In this protocol, we describe the technical procedures to generate brown adipose tissue (BAT)-specific knockout mice leveraging a combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and adeno-associated virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. The described steps include the design of the sgRNAs, the preparation of the AAV-sgRNA particles, and the microinjection of AAV into the BAT lobes.

결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...