황색포도상구균은 병인을 촉진하는 광범위한 독성 요인을 생성하는 그람 양성 박테리아입니다. 이들은 또한 PMNs 또는 호중구에게 불린 다형성 백혈구의 막 무결성을 방해하는 이중 성분 백혈구를 포함합니다. 이 비디오는 인간 전체 혈액에서 PMN의 격리와 이러한 중요한 타고난 면역 세포에 대한 S.aureus 세포 독성을 정량화하기위한 두 가지 뚜렷한 애약을 보여줍니다.
이러한 소는 모두 표준 실험실 장비로 달성 될 수 있으며 숙주 병원체 상호 작용의 다른 측면을 검사하기 쉽습니다. 이 실험은 인간 기증자에게서 온 전혈을 사용하고 적당한 기관 위원회 또는 검토 위원회의 승인 뿐 아니라 통보된 동의가 모든 참가자에게서 얻은 진술을 요구할 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 원심 분리 및 밀도 그라데이션을 사용하여 호중구를 분리하는 것입니다.
먼저, 염화 나트륨 3.9% 나트륨 50밀리리터, 염화나트륨 0.9% 밀리리터 35밀리리터, 염화나트륨 1.8%, 밀리리터 1.077g, 실온에 20밀리리터를 제공합니다. 새로 그려진 25 밀리리터의 혈액을 두 개의 원심 분리 튜브로 옮기. 25 밀리리터의 갓 뽑은 헤파린화 전혈을 실온 25밀리리터, 3%dextran, 0.9%의 염화나트륨을 일대일 비율로 결합합니다.
각 50 밀리리터 원모튜브를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 실온에서 30분 동안 방치합니다. 실온에서 인큐베이션 후 두 개의 별도의 레이어가 나타납니다. 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브로 각 dextran 혈액 혼합물의 상단 층을 전송합니다.
450g의 원심분리기는 실온에서 10분 동안 낮거나 휴식이 없습니다. 조심스럽게 슈퍼 나티판을 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 폐기하십시오. 부드럽게 0.9 %의 나트륨 염화 나트륨의 두 밀리리터에 각 세포 펠릿을 다시 중단.
재부유된 펠릿을 단일 50 밀리리터 원내로 결합한 다음 나머지 0.9%의 염화나트륨을 35밀리리터의 최종 부피에 추가합니다. 조심스럽게 손 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션 아래 밀리리터 ficoll 솔루션 당 1.077 그램의 10 밀리리터를 밑줄. 실온에서 30분 동안 450g으로 회전한 후, 낮은 또는 휴식 없이, 이전에 나타난 바와 같이 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네탄을 부드럽게 흡인시합니다.
실온 수의 20 밀리리터에서 세포 펠릿을 재보습하여 적혈구를 lyse. 30초 동안 흔들어 부드럽게 섞으세요. 실온에서 10분 동안 염화나트륨 1.8% 나트륨과 원심분리기 샘플 20밀리리터를 450g에 즉시 추가합니다.
전과 같이 신중하게 흡인 슈퍼 나일체. 2 밀리 리터 실온 RPMI에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 얼음위에 놓습니다. 대마계를 사용하여 세포를 계산합니다.
얼음 차가운 RPMI와 밀리리터 당 7 세포에 1 배 10의 농도에서 정제 된 PMN을 다시 중단하고 얼음에 유지. 정제된 PMN 100마이크로리터와 300마이크로리터의 DPBS를 결합하여 두 개의 복제 유동 세포측정 튜브에 프로디듐 요오드 얼룩 1개를 함유하고 있습니다. 양수 제어를 위해 0.5% Triton X-100 용액의 40 마이크로리터를 유동 세포측정 튜브 중 하나에 넣고 철저히 섞습니다.
흐름 세포측정을 사용하여 전방 산란, 측면 산란 및 공화 요오드 스테닝을 측정하여 격리된 PMN의 순도와 무결성을 결정합니다. 98% 이상의 PMN 제제와 95% 이상의 공화요오드 네거티브만 사용해야 합니다. 정상적인 인간 혈청의 격리를 설명하는 프로토콜의 경우 전체 원고를 참조하십시오.
이 분석에서 사용될 개별 우물에 DPBS로 희석된 20%의 격리된 인간 혈청의 100마이크로리터를 추가하여 PMN 세포 독성 분석약용 96웰 플레이트를 준비한다. 미디어만 받을 수 있는 최소 하나의 네거티브 컨트롤을 잘 포함하고 30분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 0.05%트리톤 X.Incubate로 받을 수 있는 긍정적인 컨트롤을 하나 이상 포함해야 합니다. 인큐베이션에 이어, 100 마이크로리터의 얼음 차가운 DPBS로 코딩된 우물을 두 번 씻고 접시를 얼음 위에 놓습니다.
플레이트 우물에서 잔류 DPBS를 제거하고 100 마이크로리터의 정제된 인간 PMN을 밀리리터당 7번째 세포에 1회 100마이크로리터를 양소 코딩하여 양산합니다. 다음 세포 독성 에세이에서 사용하기 전에 적어도 5 분 동안 얼음에 두어 도금 된 호중구가 정착하도록 허용하십시오. 이 섹션에서는 인간 PMN에 대한 포도상 구균에 의해 생성 된 세포 외 단백질의 세포 독성을 정량화하는 분석서를 설명합니다.
문화 S.aureus 는 실험 전날 섭씨 37도로 설정된 흔들리는 인큐베이터를 사용하여 적절한 매체에서 하룻밤 사이에. 서브컬쳐 S.aureus신선한 매체와 하룻밤 박테리아 문화의 1~100 희석을 수행 하 여. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달할 때까지 흔들리는 섭씨 37도에서 배양하십시오.
5시간 의 성장 후, 1밀리리터의 서브컬쳐 S.aureus를 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기는 실온에서 5분 동안 5, 000g으로 옮긴다. 원심 분리, 흡인 슈퍼나티에 이어. 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 흡인 된 슈퍼나티를 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 전달하고 얼음 위에 놓습니다.
스태프 아우레우스를 문화하는 데 사용되는 얼음 차가운 매체로 초월제의 연속 희석을 수행합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 얼음에 PMN이 들어 있는 96웰 플레이트의 개별 우물에 부정적이고 긍정적인 컨트롤을 위해 대여된 상피 샘플이나 미디어를 부드럽게 추가합니다. 부드럽게 바위 접시는 우물에 슈퍼 네이티퍼를 배포하고 섭씨 37도에서 배양합니다.
원하는 시간에 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 각 유동 세포측정관에 프로피듐 요오드 1마이크로리터를 함유한 300마이크로리터의 얼음 냉온 DPBS를 추가합니다. 얼음에 세포측정 튜브를 흐르도록 샘플을 옮기.
양포 제어를 잘 하려면 유동 세포측정 관으로 이송하기 전에 샘플에 10%트리톤 X의 20 마이크로리터를 추가합니다. 유동 세포측정을 사용하여 취한 PMN의 프로피듐 요오드 염색을 분석합니다. 이 섹션에서는 인간 PMN에 의한 식세포증에 따른 S.aureus의 세포 독성을 정량화하는 분석서를 설명합니다.
600 나노미터에서 광학 밀도에 의해 정의된 성장 곡선과 박테리아의 농도는 이 분석에서 사용하기 전에 관련 포도상 구균 균주에 대해 결정되어야 한다. 이전에 설명한 바와 같이 S.aureus 균주와 하위 배양 박테리아의 하룻밤 문화를 시작합니다. 서브컬쳐 스태프 아우레우스가 중간 기하급수적인 성장에 도달하면, 1밀리리터의 배양 박테리아를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기는 실온에서 5분 동안 5분, 000g으로 옮긴다.
펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 흡입하여 S.aureus를 씻고 1 밀리리터 DPBS에서 펠릿 박테리아를 다시 중단하십시오. 30초 동안 샘플을 소용돌이시다. 원심 분리는 실온에서 5 분 동안 5, 000g에서 샘플을 원심 분리합니다.
Staph 아우레우스를 소싱하려면 먼저 20 %의 인간 혈청의 1 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 15 분 동안 동요와 섭씨 37도에서 샘플을 배양. 이전에 표시된 원심분리에 따라 소소스토프 아우레우스를 세척합니다.
희석 소점 포도구균은 얼음 차가운 RPMI와 함께 밀리리터 당 8 식민지 형성 단위, CFU에 10에 10로 균주를 희석. 30초 동안 샘플을 소용돌이치며 얼음 위에 놓습니다. 한천에 박테리아의 1~10개의 연쇄 희석을 도금하여 이러한 아세약에 사용되는 Staph 아우레우스의 농도를 확인합니다.
각 Staph aureus 균주 또는 RPMI의 웰당 100 마이크로리터를 1.14단계의 얼음 위에 96웰 플레이트에 PMN에 부드럽게 추가합니다. 부드럽게 바위 접시는 우물에 Staph 아우레우스를 배포합니다. 식세포증을 섭씨 4도에서 8분 동안 500g의 원심분리판으로 동기화하고 원심 분리 직후 섭씨 37도에서 플레이트를 인큐베이션합니다.
원하는 시점에서, 얼음에 접시를 넣고 각 흐름 세포측정 관에 하나의 마이크로 리터 프로디듐 요오드를 포함하는 얼음 차가운 DPBS의 200 마이크로 리터를 추가 한 다음 해당 튜브에 샘플을 전송합니다. 2.8 및 2.9에 기술된 바와 같이 유동 세포측정을 사용하여 요오드 염색에 대한 샘플을 분석한다. Staph aureus에 의해 인간 PMN을 표적으로 하는 이중 성분 백혈병의 전사는 인간 PMN에 대하여 Staph aureus 세포 독성을 정량화하기 위한 기술된 약의 유용성을 보여주기 위하여 SA 또는 S2 분대 계통을 요구합니다.
이러한 실험은 이 균주에 있는 SA 또는 S의 isologenic 삭제 돌연변이에서 USA300으로 확인된 임상적으로 관련있는 Staph aureus 격리로 수행되었다. 왼쪽 패널은 정제된 PMN을 묘사하고 오른쪽 패널은 의도적으로 오염된 샘플을 예로 묘사합니다. PMN은 이 프로토콜 중 하나에 설명된 절차를 사용하여 분리되어 프로피듐 요오드로 염색하고 유동 세포측정을 사용하여 검사했습니다.
전방 및 측면 산란 플롯은 1년 동안 단백구 또는 림프구에 의한 정제된 PMN의 오염을 검출하는 데 사용되었다. 인간 PMN 정화의 설명된 방법을 사용하여, 우리는 지속적으로 98% 이상이고 95% 이상 인 8 PMN에 7번에서 1배에서 1배까지 5회 10번에서 1회까지 일관되게 분리할 수 있으며 95% 이상의 요오드네이다.
USA300 및 AsaeR/S 돌연변이에 의해 생성된 세포 외 단백질의 세포 독성은 정제된 PMN에 대하여 시험되었습니다. 이러한 실험은 USA300에 의해 생성된 세포외 단백질로 30분 동안 중독된 후 정제된 PMN의 공화 요오드 염색에 대한 집중 의존적 증가를 보여 주지만, 아사에R/S 돌연변이체는 그렇지 않다. 추가 실험은 약 30분 후에 고원한 USA300 세포외 단백질에 의한 중독 에 따른 프로피듐 요오드 양성 PMN의 비율에서 꾸준한 증가를 입증하였다.
인간 PMN의 최소 프로피듐 요오드 염색은 AsaeR/S 돌연변이체에 의해 생성된 세포외 단백질에 노출된 후 모든 시점에서 주목되었다. 마지막으로, 동기화된 식세포증에 따른 PMN에 대한 USA300 및 아사에R/S 돌연변이의 세포독성이 시험되었고, 미국300의 식세포증 후 90분 후 요오드 양성 PMN의 농도 의존성 증가가 관찰되었다. 상당히 적은 PMN은 아사에R/S 돌연변이의 phagocytosis 다음 프로피듐 요오드 양성이었다.
USA300 및 AsaeR/S 돌연변이 접종의 열거는 이들 실험의 각각에 사용되었으며, 이러한 균주 들 사이의 세포 독성의 대조는 사용되는 박테리아의 농도의 차이 때문이 아니라는 것을 입증하였다. 이 프로토콜은 이러한 타고난 면역 세포에 대한 S.aureus의 세포 독성을 정량화하기위한 두 가지 뚜렷한 기술에서 인간의 혈액에서 PMN의 정제를 설명합니다. 이러한 절차의 성공은 정제 된 PMN의 품질과 Staph 아우레우스 박테리아 또는 초월제의 적절한 준비에 달려 있습니다.
이러한 절차를 수행하는 동안 고려해야 할 중요한 사항은 전체 원고를 참조하십시오. USA300은 악성 MRSA 분리 및 AsaeR/S의 손실은 인간 PMN을 대상으로 하는 독성 요인의 전사를 극적으로 감소시켜, 이러한 균주가 설명된 에세이를 사용하여 세포 독성을 비교하기에 이상적인 모델을 만드는 것입니다. 포도상 구균의 다른 균주를 사용할 때 성장 조건, 추가된 수퍼나티의 부, 또는 PMN에 대한 박테리아의 비율을 조정하는 것이 필요할 수 있다.
