효소 보호 분석은 포도상 구레나귀 내재화의 정도와 부착 세포 내부에서 살아남을 수있는 능력뿐만 아니라 항균 화합물의 효능을 연구 할 수 있게합니다. 개선된 효소 보호 분석은 기술적 취급을 크게 단순화하고, 현탁액에 있는 약하게 부착된 세포 및 세포에서 내재된 박테리아를 복구할 수 있게 합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 Josselin Rigaill, 의사 및 박사 과정 학생이 될 것입니다.
감염 분석 이틀 전, 종자 A549 상피 세포는 24웰 플레이트당 밀리리터 당 5세포당 2.0배 10배, 세포를 5%의 이산화탄소로 섭씨 36도에서 48시간 동안 배양하여 100%의 인플루언서에 도달할 때까지 세포를 배양한다. 분석 당일, A549 세포를 계수하기 위한 3개의 우물에서 소비된 배양 배지를 제거하고 폐기하고, Hoechst 33342의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 포함하는 완전한 감염 배지의 1밀리리터와 프로피듐 요오드의 밀리리터당 1마이크로그램을 첨가한다. 세포를 30분 동안 배양한 다음, 광야 형광 현미경을 사용하여 세포 수를 계산하고 세포 생존가능성을 계산합니다.
세균 현탁액을 준비하려면 튜브에 완전한 감염 배지25 밀리리터를 분배하고 섭씨 36도에서 예동하십시오. 다음으로, 세포 밀도 계를 이용하여 완전한 감염 배지에서 0.5의 OD로 황색포도상구균 현탁액을 조정한 다음, 완전한 감염 배지에서 배양을 희석시켜 세포 접종을 위한 세균현탁액의 20밀리리터를 준비하여 양산한 세포의 수에 따라 하나의 MOI를 달성한다. 다음으로, 자동 나선형 플래터를 사용하여, 세포 접종 단계에 사용되는 희석된 세균 현탁액의 황색포도상구균 하중을 결정하고, 36°C에서 18~24시간 동안 천고판을 배양한다.
다음 날, 콜로니 카운터가 있는 콜로니 수를 계산하여 테스트된 각 변형에 대한 정확한 MOI를 계산합니다. 세포 접종 전에, 낮은 배율 현미경 검사법에 의해 24웰 플레이트의 모든 우물을 관찰하여 세포가 건강하고 예상대로 자라도록 한 다음, 24웰 플레이트에서 소비된 세포 배양 배지를 제거하고 폐기하고 100% 컨캔트 세포를 함유하는 각 웰에 세균현탁액의 500마이크로리터를 첨가한다. 5%의 이산화탄소에서 섭씨 36도에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.
향상된 효소 보호 분석으로 세포내 세균을 정량화하려면 텍스트 원고에 언급된 대로 작업 용액에서 4배 용해 완충제, 2%트리톤 X-100, 트립신-EDTA 및 리조스타핀 스톡을 준비한다. 다음으로, 리소스타핀 작업 용액의 250 마이크로리터에 완전한 감염 배지의 6밀리리터를 추가하여 리소스타핀으로 보충된 완전한 감염 배지의 6.25 밀리리터를 준비한다. 그런 다음 리조스타핀으로 보충된 전체 감염 배지의 250마이크로리터를 각 우물에 넣고 손으로 접시를 휘저어 부드럽게 접시를 교반합니다.
리소스타핀이 세포외 박테리아를 죽일 수 있도록 하려면, 세포가 이산화탄소 5%에서 섭씨 36도에서 1시간 동안 배양한 다음, 밀리리터당 20 마이크로그램에 단백질라제 K 10마이크로리터를 추가하고 실온에서 2분 동안 세포를 배양하여 리조스타핀을 비활성화합니다. 다음으로, 4x 리시스 버퍼250마이크로리터를 추가하여 삼투성 쇼크에 의해 세포를 용해시키고, 섭씨 36도에서 10분 동안 세포를 배양한다. 인큐베이션 후, 파이펫 세포는 세포가 완전히 lysed 및 균질화되도록 여러 번 lysate, 다음 각 우물의 황색 포도상 구균 하중을 결정하고 36 섭씨에서 18 ~ 24 시간 동안 천어 플레이트를 배양하기 위해 자동 나선형 플래터를 사용합니다.
다음 날, 각 우물의 세포내 황색포도상구균 부하를 계산하기 위해 식민지 카운터와 식민지의 수를 계산합니다. A549 상피 세포에 의한 황색포도상구균 의 2개의 긴장의 내산화는 여기에서 묘사됩니다. 리소스타핀을 제거하기 위한 세하를 포함하는 효소 보호 분석서를 사용하여, 평균 세포내 하중은 각각 fnbA 및 B 유전자가 결여된 SF8300 야생형 및 동위원소 돌연변이제에 대한 밀리리터당 4.46 및 0.49 로그 차르였다.
리조스타핀을 비활성화하기 위해 단백질효소 K를 사용하는 개선된 효소 보호 분석체를 사용하여, 하중은 밀리리터당 각각 4.53 및 0.56 로그 차푸였다. 효소 보호 분석체를 사용하여 측정된 황색포도상구균에 대한 반코미신, 리팜피신 및 레보플로록사신의 세포내 활성이 여기에 묘사된다. 평균 세포 내 하중은 제어를위한 밀리리터 당 4.57 로그 cfu, 밴코미신4.51, 리팜피신의 경우 3.03, 레보플로록사신의 경우 2.91개였습니다.
효소를 제거하기 위한 집중적인 세차하는 경향이 가장 감염된 세포를 분리하는 경향이 있으며, 이는 부정확한 결과를 제공하고 개선된 프로토콜의 사용을 지원할 수 있다. 개선된 효소 보호 분석으로 포도구균 내산화를 쉽게 연구할 수 있으며, 퍼팅으로 사용되는 고함량 스크리닝 시스템에 쉽게 적응할 수 있습니다.
