플라스미드는 세포 사이와 인구 사이를 이동할 수 있기 때문에 측면 유전자 전달의 아주 중요한 에이전트인 대부분의 세균성 종 및 서식지에서 유비쿼터스인 초염색체 원소입니다. 그 같은 전송의 가장 눈에 띄는 눈에 띄는 눈에 띄는 예 중 하나는 플라스미드에 인코딩 된 항생제 저항 유전자의 보급이다. 항생제 내성 유전자를 인코딩하는 모델 플라스미드를 만들려면 플라스미드 백본을 선택하고 PCR은 플라스미드 템플릿에 결합되는 높은 충실도 폴리머라제와 프라이머를 사용하여 백본을 증폭시합니다. 우리의 경우 우리는 pBBR1 플라스미드 백본을 사용했습니다. 다음으로, 고충실도 폴리머라제를 이용하여 네이티브 Tn5 프로모터를 포함하는 내성 유전자 nptII를 증폭한다. 플라스미드 백본에 대한 서열 상보성의 약 20개의 기본 쌍을 가진 저항 유전자에 대한 프라이머를 설계한다. PCR 후, 정제된 저항 유전자 PCR 제품의 상동성 영역을 60분 동안 50도에서 이더스말 어셈블리를 사용하여 정제된 플라스미드 백본에 융합한다. 융합된 제품을 전기포공을 사용하여 E.Coli DH5-Alpha로 변환합니다. 선택적 매체에 혼합물의 100 마이크로리터를 플레이트하고 약 24시간 동안 37도에서 배양한다. 플라스미드는 추출, 검증 및 대장균 야생 형 균주 MG1655로 변환 할 수 있습니다. 이 수율 균주 MG1655 pCON.항생제 노출 하는 동안, 박테리아는 살아남기 위해 플라스미드를 필요로. 따라서, 플라스미드는 긍정적 인 선택하에있다. 비 선택적 조건하에서, 그래서 항생제없이, 플라스미드는 세포에 일회용이다. 우리의 연구의 목적은 시간이 지남에 따라 이러한 비 선택적 조건하에서 플라스미드를 따르는 것이었습니다. 이를 위해, 우리는 항생제 내성 유전자를 가진 작은 플라스미드를 장착하고 대장균에 그것을 소개했습니다. 우리는 진화 실험을 실시하고 복제 도금을 통해 플라스미드 주파수를 모니터링했습니다. 플라스미드 운반 균주 mg1655 pCON은 이제 진화 실험에 도입된다. 첫 번째, 플레이트 mg1655 pCON 에 LB 한천 접시 항생제로 보충 하 고 37도에서 하룻밤 배양. 이 접시에서 무작위로 8 조상 식민지를 선택하고 일정한 흔들림과 함께 37도에서 하룻밤 을 배양. 다음 날, 인구는 96 개의 깊은 우물 판에서 수행되는 실험으로 옮겨져 있습니다. 복제본을 플레이트 전체에 무작위로 분배하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어 바둑판 접근 방식에서. 우리의 실험에서 문화권은 희석되고 다른 희석속도와 두 가지 온도로 전달됩니다. 모든 전송 이벤트 동안 희석 처리가 적용되고 직렬 전송은 총 98 회 전송을 통해 반복됩니다. 진화 실험을 통해 인구에서 플라스미드의 빈도는 플라스미드 운반 세포의 비율에서 추정된다. 복제 도금은 1950 년대에 에스더와 조슈아 레더 버그에 의해 대중화 되었다 그들은 박테리아에서 약물 저항을 공부 하기 위해 그것을 사용. 이 방법은 표현형을 위해 그들의 스캐닝을 고급화할 수 있게 하고 연구 결과의 끝에 페니실린 저항이 게놈에 있는 자발적인 돌연변이 때문에 박테리아에서 생길 수 있다는 것을 밝혔습니다. 실험 중 인구의 플라스미드 주파수를 결정하기 위해 고정 배양은 비선택적 LB 천판에 연재적으로 희석되고 도금됩니다. 플레이트당 250 내지 500개의 콜로니의 수율에 따라 희석을 조정한다. 도금 된 인구는 24 시간 미만 37도에서 하룻밤 성장을 위해 배양됩니다. 식민지는 여전히 작을 때 복제하는 것이 가장 좋습니다. 하룻밤 성장 후 독자의 선택의 자동화 된 식민지 카운터를 사용하여 모든 식민지를 계산합니다. 이 배양에 총 박테리아 인구 크기를 산출. 플레이트 가장자리에 있는 식민지는 제외해야 합니다. 플레이트를 복제하려면 항생제로 보충된 선택적 한천 판, 둥근 블록, 블록에 맞는 금속 링 및 멸균 벨벳 천이 필요합니다. 이 자동 clavation에 의해 살균 할 수 있기 때문에 천은 100 % 면이 될 필요가있다. 블록에 천을 놓고 금속 반지로 고정합니다.조심스럽게 고정 벨벳 천 표면에 계산 된 식민지와 접시를 배치합니다. 모든 플레이트 표면이 천에 닿도록 원을 그리며 접시를 누릅니다. 모든 식민지가 벨벳을 만지는 것이 매우 중요합니다. LB 플레이트를 제거하고 선택 접시를 벨벳에 놓습니다. 주의 깊게 두드리는 것을 반복합니다. 접시가 벨벳에 완전히 닿는 것이 다시 중요합니다. 그 후, 선택적 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 하룻밤 동안 실온에서 배양됩니다. 다음 날, LB와 항생제 플레이트 모두 평가를 위해 필요합니다. 플레이트를 서로 위에 놓고 성장을 비교합니다. 식민지없는 공간을 쉽게 발견 할 수 있습니다. 이들은 항생제에 저항하지 않는 식민지입니다. 따라서, 이 식민지는 플라스미드를 잃었다. 결국, 항생제 판에 얼마나 많은 식민지가 누락되어 있는지 표시하십시오. 이 숫자는 당신에게 플라스미드 손실을 제공합니다. 진화 실험 주간 동안 모든 모집단의 복제도금을 반복한다. 플라스미드 손실은 플라스미드 다중 기형에 의해 발생할 수 있습니다. 플라스미드 구조에서 작업할 때 선호하는 숙주 변형에 주어진 유전자의 발현을 위해 국가가 취할 수 있는 확인과 관련하여 생체 내에서 플라스미드의 토착 행동은 일반적으로 간과되는 것이 간과된다. 그러나 진화적 맥락에서 그러한 변화의 확인은 매우 중요할 수 있습니다. 플라스미드 확인의 분석은 매우 까다로운 노력이 될 수 있습니다. 특히 플라스미드 멀티머는 PCR이나 시퀀싱으로 제대로 식별할 수 없기 때문에 분석하기 어렵다. 다른 한편으로는, 플라스미드 멀티머는 잠재적으로 큰 크기와 느린 전기 포동성 이동성 때문에 젤 전기 전광에 의해 분석하기 어렵습니다. 우리의 프로토콜은 내가 어떤 주어진 플라스미드 준비를 말할 것이다 에서 플라스미드 멀티머의 선별 및 식별을위한 간단하고 간단한 방법을 제공합니다. 시각적 플라스미드 분자는 알칼리성 용액을 사용하여 5 mL 고정 하룻밤 세포 배양에서 플라스미드를 추출한다. 낮은 복사 플라스미드의 플라스미드 추출은 종종 시각화 전에 소화해야 숙주 염색체 DNA로 오염으로 이어집니다. 염색체 DNA 오염을 제거하려면 플라스미드-세이프로 추출된 플라스미드 DNA를 치료합니다.
