이 연구는 캐나다 자연과학 및 공학 위원회(Natural Science and Engineering Council of Canada)가 AK에 제공한 디스커버리 그랜트(Discovery Grant)의 지원을 받았습니다. 그림에 사용된 회로도는 BioRender.com 로 작성됩니다.

1. 실험 준비
<ol><li>플라스미드 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (삽입 플라스미드, 그림 2A)를 관심 유전자로 정제합니다. 참고: 여기서 관심 유전자는 adeIJK입니다. 최종 플라스미드 농도는 ≥100ng/μL입니다.</li>
	<li>helper plasmid (pTNS2)9 및 excision plasmid (pFLP2ab)6 (각각 그림 2B,C)를 최종 plasmid DNA 농도 ≥100 ng/μL로 정제합니다.</li>
	<li>멸균 초순수 50mL와 멸균 LB(Lennox) 육수 25mL를 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>각각 플레인(첨가제 없음), 50μg/mL의 겐타마이신(Gm), 200μg/mL의 카르베니실린(Cb)(암피실린 내성 유전자를 통한 선택용) 및 5% 자당( 재료 표 참조)과 같은 첨가제가 포함된 최소 10LB 한천 플레이트를 준비합니다.</li>
	<li>LB 한천에 삽입하는 데 사용할 균주를 줄무늬 제거하고 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다. 여기서, A. baumannii AB258이 사용된다. 알림: 이 프로토콜은 벤치 또는 생물 안전 캐비닛에서 Bunsen 버너를 사용하여 가능한 한 멸균 환경에서 수행해야 합니다. 모든 소모품(피펫 팁, 접종 루프, 마이크로퓨지 튜브 등)은 멸균해야 합니다.</li>
</ol>2. 문화 준비
<ol><li>멸균 접종 루프 또는 멸균 나무 접종 스틱을 사용하여 멸균 13mL 배양 튜브의 LB 육수 4mL에 A. baumannii AB258 단일 콜로니를 접종합니다. 참고: 단일 4mL 배양액이 하나의 시료와 대조군에 사용됩니다. 필요한 샘플 수에 따라 배양 수를 늘립니다.</li>
	<li>37°C에서 진탕(250 rpm)하여 밤새 배양합니다.</li>
	<li>멸균 증류수(25-50mL) 한 병을 4°C에서 밤새 두어 3단계에서 사용합니다.</li>
</ol>3. 전기 유능한 셀의 준비
<ol><li>모든 멸균 1.5mL 마이크로프리지 튜브(배양액당 2개)와 멸균 전기천공법 큐벳(배양액당 2개)을 얼음 위에 놓습니다( 재료 표 참조). 절차 내내 샘플을 가능한 한 얼음 위에 두십시오.</li>
	<li>4 °C에서 보관된 멸균수 병을 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>하룻밤 동안 배양된 박테리아 배양 1.5mL를 1.5mL 마이크로퓨지 튜브 중 하나에 옮깁니다.</li>
	<li>13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 펠트합니다. 알림: 원심분리는 4°C에서 수행하는 것이 이상적이지만 주변 온도 원심분리는 허용되며 해롭지 않습니다.</li>
	<li>1mL 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 방해하지 않고 모든 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>동일한 미세분리 튜브에 1.5mL의 박테리아 배양액을 추가합니다. 13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 모든 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>나머지 배양액 1mL로 마지막으로 3.6단계를 반복합니다.</li>
	<li>1mL의 얼음처럼 차가운 멸균수를 세포 펠릿에 넣고 펠릿이 더 이상 마이크로퓨지 튜브 바닥에 놓이지 않을 때까지 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다.</li>
	<li>재현탁 세포를 13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>1mL 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 특히 세포가 덜 조밀한 펠릿을 형성하는 경향이 있는 후속 세척 단계에서 상층액을 붓지 마십시오.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 멸균수로 이 세척 단계를 3.8단계부터 3.10단계까지 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>최종 세포 펠릿을 200μL의 얼음처럼 차가운 멸균수에 부드럽게 재현탁시킵니다.</li>
	<li>최종 셀 현탁액 100μL를 두 번째 얼음처럼 차가운 1.5mL 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 이 두 번째 부분 표본은 electroporation에 대한 음성 대조군이 될 것입니다. 세포 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>4. 전기천공법
<ol><li>각 샘플에 대해 LB 육수 1mL와 LB + Gm50 한천 플레이트 1개(1.4단계에서 준비)를 예열하고 37°C로 설정된 정적 인큐베이터에서 대조군을 예열합니다.</li>
	<li>5 μL 이하의 결합 부피에서, pTNS2 helper plasmid 및 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK insertion plasmid를 각각 100-200 ng를 electrocompetent cell의 분취액에 첨가합니다.</li>
	<li>손가락 끝으로 가볍게 두드려 혼합하여 기포를 발생시키지 않고 플라스미드와 전기 능력이 있는 세포가 완전히 혼합되도록 합니다.</li>
	<li>동일한 양의 멸균 증류수를 음성 대조군 세포 부분 표본에 넣고 위와 같이 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>전체 세포 샘플을 얼음처럼 차가운 전기천공법 큐벳으로 옮긴 다음 큐벳을 다시 얼음 위에 놓습니다. 음성 대조군 세포 샘플에 대해 반복합니다.</li>
	<li>세포 샘플을 전기합니다.<ol><li>electroporator를 켜고 2.0kV(25μF, 200 Ω)로 설정합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>부드러운 티슈로 큐벳 표면을 닦아 붙은 얼음이나 습기를 제거합니다.</li>
		<li>큐벳을 electroporator에 삽입하고 전기 충격을 가하십시오.</li>
		<li>즉시 0.9mL의 미리 데워진 LB 육수를 큐벳의 세포에 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 배지와 혼합합니다.</li>
		<li>전체 세포 현탁액을 새로운 1.5mL 미세분리 튜브(실온)로 옮깁니다.</li>
		<li>electroporator의 시간 상수 값을 확인하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 이 값이 4에서 6 사이여야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>음성 대조군 세포 샘플에 대해 전기천공법 절차(4.7.1 - 4.7.6 단계)를 반복합니다.</li>
	<li>세포 회수를 위해 37°C에서 250rpm에서 1시간 동안 전기천공된 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>접종 스프레더를 사용하여 각 전기천공법 셀 샘플 100μL를 예열된 LB + Gm50 한천 플레이트에 펴 바릅니다.<ol><li>나머지 샘플을 13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 펠트합니다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 모든 상층액을 제거한 후 100μL의 LB 육수에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
		<li>각 전체 샘플을 미리 예열된 개별 LB + Gm50 한천 플레이트에 펼칩니다. 참고: 전기천공법 효율은 변형률에 따라 달라질 수 있습니다. 변형을 처음으로 전기포칭할 때 전기천공법 샘플의 다양한 부피 또는 희석을 도금하여 결과 플레이트에 분리된 콜로니가 있는지 확인하는 것이 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>5. PCR 기반 스크리닝을 위한 형질전환된 콜로니 선택
<ol><li>electroporation 플레이트를 확인하십시오. 네거티브 컨트롤에는 식민지가 없어야 합니다. 샘플에는 고유한 콜로니가 있어야 합니다. 참고: 콜로니가 있는 플레이트는 이 단계와 콜로니 또는 패치가 있는 한천 플레이트가 생산되는 모든 후속 단계에서 진행하기 전에 최대 4°C에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 이쑤시개를 사용하여 LB + Gm50 한천 플레이트에서 최대 10개의 단일 콜로니를 선택하여 새 LB + Gm50 한천 플레이트에 패치합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>6. 콜로니 PCR에 의한 염색체 삽입 확인
<ol><li>패치된 콜로니가 들어 있는 LB + Gm50 한천 플레이트를 인큐베이터에서 제거합니다.</li>
	<li>멸균 이쑤시개 또는 멸균 피펫 팁을 사용하여 패치에서 0.2mL PCR 튜브에 있는 20μL의 멸균 증류수에 소량(큰 콜로니 크기)을 제거합니다. 잘 섞는다. 물 sample은 세포가 이쑤시개에서 방출될 때 눈에 띄게 뿌옇게 변해야 합니다. 스크리닝해야 하는 샘플을 원하는 수만큼 준비하되 6개면 충분합니다.</li>
	<li>박테리아 현탁액이 들어 있는 PCR 튜브를 100°C에서 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>미니 원심분리기( 재료 표 참조)를 사용하여 샘플을 고정된 최대 속도로 2분 동안 회전시켜 세포 파편을 펠릿화합니다.</li>
	<li>상층액을 새 0.2mL PCR 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 이 샘플에는 PCR 반응에 대한 템플릿 DNA가 포함되어 있습니다. 참고: 이 템플릿 DNA는 PCR을 진행하기 전에 -20°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>총 부피 25μL에서 1x 중합효소 완충액, 200μM dNTP, 0.18μM ABglmS2_F_New 순방향 프라이머, 0.18μM Tn7R 역방향 프라이머(표 1), Taq DNA 중합효소 1U 및 준비된 템플릿 DNA 1μL를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 템플릿 DNA를 제외한 모든 것을 포함하는 템플릿 없는 대조군(NTC)을 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>반응 조건을 열 순환기에 입력: 95분 동안 2°C; 95초 동안 30°C, 49초 동안 30°C, 총 35주기 동안 72초 동안 30°C; 72분 동안 10°C; 12 °C 유지. 샘플을 실행합니다.</li>
	<li>DNA 로딩 염료를 최종 농도 1x에 첨가한 후 각 PCR 반응의 10μL를 2% 아가로스 겔에 로드하고 80V에서 40분 동안 실행합니다. 이 프라이머 쌍의 예상 앰플리콘 크기는 382bp입니다. NTC에는 밴드가 없어야 합니다.</li>
	<li>예상 PCR 산물을 생산한 샘플을 식별합니다. PCR 양성 패치의 LB + Gm50 한천 플레이트에 줄무늬 플레이트를 준비합니다. 37 °C에서 16-18 시간 동안 배양합니다. 목표는 글리세롤 스톡을 준비하기 위해 단일 콜로니를 갖는 플레이트를 생성하여 이 표시된 균주를 보존하고 표시되지 않은 균주를 생성하기 위한 출발점으로 만드는 것입니다(아래 설명 참조).</li>
</ol>7.pFLP2 ab를 이용한 GmR 마커 제거
<ol><li>2단계: 문화권 준비에 설명된 절차를 따릅니다. 오버나이트 배양을 제조하기 위해 사용된 샘플은 단계 6.9에서 개별 콜로니를 생성하기 위해 제조된 LB+Gm50 한천 플레이트로부터의 단일 콜로니이다.</li>
	<li>3 단계 : 전기 능력 전지 준비에 언급 된 절차를 따르십시오. 전기천공법을 위해 하룻밤 배양에서 세포를 준비합니다.</li>
	<li>4단계: 전기천공법에서 언급한 절차를 따르십시오. 여기서 세포에 도입할 플라스미드는 pFLP2ab (100-200 ng)이며, 이는 염색체로 삽입된 관심 유전자 옆에 있는 겐타마이신 내성 유전자를 제거합니다.</li>
	<li>세포가 1시간 동안 회복된 후(단계 4.9), 100μL의 전기천공된 세포 샘플을 예열된 LB +Cb 200 한천 플레이트(단계 1.4에서 준비)에 퍼뜨립니다. 이러한 선택적 압력은 pFLP2ab 절제 플라스미드를 보유한 세포만 성장하도록 합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트에 콜로니가 있는지 확인하십시오. 네거티브 컨트롤 플레이트에는 콜로니가 없어야 합니다. LB + Cb200 한천 샘플 플레이트에는 뚜렷한 콜로니가 있어야 합니다.</li>
	<li>멸균 이쑤시개를 사용하여 LB + Cb200 한천 플레이트 및 LB + Gm50 한천 플레이트에 최대 20개의 분리된 콜로니를 교차 패치합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트에 패치가 있는지 확인하십시오. LB + Cb200 한천 플레이트에서 성장하지만 LB + Gm50 한천 플레이트에서 성장하지 않는 클론은 원래 삽입물에서 겐타마이신 내성 유전자가 제거되었습니다.</li>
	<li>박테리아에서 pFLP2ab 플라스미드를 강제로 배출하는 5%(w/v) sucrose가 보충된 개별 LB 한천 플레이트에 카베니실린 내성 및 겐타마이신이 줄무늬가 생기기 쉬운 패치를 선택합니다. 최대 10개의 식민지를 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트에 콜로니가 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>pFLP2ab 플라스미드 손실의 최종 확인으로서, 5% 슈크로스 플레이트에서 분리한 콜로니를 LB + Cb200 한천 플레이트 및 LB 한천 플레이트에 교차 패치합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>LB 한천 플레이트에서 성장하고 있는 클론을 선택하고, 이 표시되지 않은 균주를 보존하기 위해 글리세롤 스톡을 준비하기 위해 카르베니실린에 민감한 클론을 선택하십시오.<ol><li>표시되지 않은 균주의 유전자 검증은 겐타마이신 내성 유전자를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR(6단계: 콜로니 PCR에 의한 염색체 삽입 확인)로 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>총 부피 25μL에 1x 중합효소 완충액, 200μM dNTP, 0.18μM Gm_F 순방향 프라이머, 0.18μM Gm_R 역방향 프라이머(표 1), Taq DNA 중합효소 1U 및 준비된 템플릿 DNA 1μL를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 템플릿 DNA를 제외한 모든 것을 포함하는 no-template control(NTC)을 준비하고, 표시된 균주의 DNA를 사용하는 양성 대조군.</li>
		<li>반응 조건을 열 순환기에 입력: 95분 동안 2°C; 95초 동안 30°C, 50초 동안 30°C, 총 72회 주기 동안 40초 동안 35°C; 72분 동안 10°C; 12 °C 유지. 샘플을 실행합니다.</li>
		<li>DNA 로딩 염료를 최종 농도 1x에 첨가한 후 각 PCR 반응의 10μL를 1% 아가로스 겔에 로드하고 80V에서 40분 동안 실행합니다. 이 프라이머 쌍의 예상 앰플리콘 크기는 525bp입니다. 양성 대조군에는 단일 밴드가 있어야 합니다. 샘플과 NTC에는 밴드가 없어야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

Multidrug Efflux 시스템 특성화를 위한 Single-copy 유전자 발현

<ol>
	<li>Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12">https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12</a> (2017)</li><li>Kornelsen, V., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+multidrug+resistance+efflux+pumps+in+Acinetobacter+spp.">Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).</li><li>Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+genetic+tools+for+Acinetobacter+baumannii.">Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii.</a> Front Genet. 11, 601380 (2020).</li><li>Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+regulated+expression+of+single-copy+efflux+pump+genes+in+a+surrogate+Pseudomonas+aeruginosa+strain:+identification+of+the+BpeEF-OprC+chloramphenicol+and+trimethoprim+efflux+pump+of+Burkholderia+pseudomallei+1026b.">Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).</li><li>Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+single+copy+gene+cloning+in+Acinetobacter+baumannii.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii.</a> J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).</li><li>Ducas-Mowchun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+Tn7-based+single-copy+insertion+elements+for+use+in+multi-+and+pan-drug+resistant+strains+of+Acinetobacter+baumannii.">Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).</li><li>Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+single-copy+insertion+vectors+for+Acinetobacter+baumannii.">Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii.</a> Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).</li><li>Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Flp-FRT+system+in+bacterial+genetics.">Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics.</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).</li><li>Choi, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tn7-based+broad-range+bacterial+cloning+and+expression+system.">A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.</a> Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atorvastatin+does+not+display+an+antimicrobial+activity+on+its+own+nor+potentiates+the+activity+of+other+antibiotics+against+Acinetobacter+baumannii+ATCC+17978+or+A.+baumannii+AB030.">Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030.</a> Access Microbiol. 3, 000288 (2021).</li><li>Reyrat, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).</li><li>Gay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+procedure+for+entrapment+of+insertion+sequence+elements+in+gram-negative+bacteria.">Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria.</a> J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).</li><li>Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tragiannidis,+Acinetobacter+baumannii+antibiotic+resistance+mechanisms.">Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms.</a> Pathogens. 10 (3), 373 (2021).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+standards+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.</a> CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).</li><li>Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increasing+threat+in+hospitals:+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii.">An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).</li><li>Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+parameters+for+high+efficiency+transformation+of+Acinetobacter+baumannii.">Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii.</a> Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).</li><li>Thompson, M. G., Yildirim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Acinetobacter+baumannii:+electroporation.">Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation.</a> Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).</li><li>Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+multiple+glmS-linked+attTn7+sites:+example+Burkolderia+mallei+ATCC+2334.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334.</a> Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).</li><li>Jittawuttipoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+gene+cloning+at+a+single+copy+number+in+an+industrially+important+and+phytopathogenic+bacteria,+Xanthomonas+spp.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp.</a> FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).</li><li>P&#233;rez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., V&#225;zquez-Torres, A., Rather, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RelA+in+Acinetobacter+baumannii.">Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii.</a> J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).</li><li>Williams, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Acinetobacter+baumannii+copper+resistance+reveals+a+role+in+virulence.">Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence.</a> Front Microbiol. 11, 16 (2020).</li></ol>

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A. baumannii에서 유도 가능한 단일 복제 유전자 발현 시스템의 염색체 삽입을 위한 이 절차는 기술적으로 간단하고 노동 집약적이지 않지만 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 유능한 세포의 준비는 배지를 얼음처럼 차가운 물로 교체하는 동안 세포가 약해지기 때문에 가능한 한 얼음 위에서 수행되어야 합니다. 이상적으로는 원심분리 단계가 4°C에서 수행되지만 실온에서 ?...

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )는 모든 종류의 항생제에 대한 내성으로 인해 세계보건기구(WHO)의 최우선 순위 병원체입니다1. 주로 입원, 부상 또는 면역력이 저하된 사람들에게 영향을 미치는 기회 병원체입니다. A. baumannii 는 유출 펌프 를 통해 항생제를 주로 회피하며, 가장 관련성이 높은 것은 RND(Resistance-Nodulation-Division) 수출업체제품군입니다 2. 이러한 유출 펌프가 기계적으로 어떻게 작동하는지 이해하면 표적 치료 옵션을 개발할 수 있습니다.
세포 과정을 구체적으로 구별할 수 있는 한 가지 일반적인 방법은 유전자 조작을 통해서입니다. 그러나 A. baumannii 유전자 연구에 사용할 수 있는 도구는 제한적이며, 실험 설계를 더욱 혼란스럽게 하기 위해 임상 분리물은 종종 유전자 조작에서 선택에 일상적으로 사용되는 항생제에 내성이 있습니다3. 특히 유출 펌프를 연구할 때 직면하는 두 번째 장애물은 종종 알려지지 않은 요인에 의해 엄격하게 규제되어 단일 펌프로 기능을 정확하게 분리하고 귀속시키기가 어렵다는 것입니다4. 연구 도구 상자를 확장해야 할 필요성을 인식하여 선택 마커 5,6,7을 제거할 수 있는 Flp 재조합 표적(FRT) 카세트를 통합하는 mini-Tn7 기반의 단일 복제 삽입 유도 발현 시스템을 개발했습니다(그림 1). 슈도모나스 8,9,10을 위해 처음 만들어진 이 우아한 클로닝 및 발현 시스템은 A. baumannii(ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: 이하 A. baumannii AB258)의 RND 유출 펌프 결핍 균주에 단일 복제 유출 펌프 보완체를 생성하는 데 사용되었으며,11. 한 번에 하나의 유출 펌프를 연구할 수 있고 높은 복제 발현으로 박테리아 세포를 압도하지 않을 수 있기 때문에(일반적으로 플라스미드 기반 발현 시스템에서 볼 수 있음) 간섭을 최소화하고 합병증을 줄이면서 각 유출 펌프의 중요한 생리학적 측면에 대해 더 잘 배울 수 있습니다.
이 논문은 mini-Tn7 시스템을 사용하여 9일 동안 수행된 일련의 복잡하지 않은 단계를 통해 A. baumannii AB258의 염색체에 삭제된 관심 유전자인 RND 유출 펌프 adeIJK를 보완하는 방법을 설명합니다7. 첫 번째 단계는 잘 보존된 glmS 유전자(그림 3A)의 단일 attTn7 삽입 부위에서 mini-Tn7 기반 삽입 플라스미드(그림 2A)에 클로닝된 삭제된 유출 펌프 유전자를 다시 도입합니다. 이 과정은 Tn7 유도 삽입에 필요한 transposase 유전자를 암호화하는 non-replicative helper plasmid (그림 2B)에 의해 촉진됩니다. 두 번째 단계는 FRT 부위 측면에 있는 겐타마이신 유전자의 Flp 재조합 효소 매개 제거를 위해 절제 플라스미드(그림 2C)를 사용하여 표시되지 않은 균주를 생성합니다(그림 3B). 이 시스템은 항생제 내성과 관련하여 RND 유출 펌프의 필수 역할과 가능한 억제제를 밝히는 데 사용되지만 관심 유전자를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td>For colony boil preparations and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72-690-301</td>
			<td>General use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-mL culture tubes, Pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-957K</td>
			<td>Liquid culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>LD010</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>351271-212</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR003</td>
			<td>Solid growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8&#8211;2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis unit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-237-54</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50841231</td>
			<td>Selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube closures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-684-138</td>
			<td>Stainless steel closure for 13-mL culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>DD0058</td>
			<td>PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath/block heater</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88860023</td>
			<td>Isotemp digital dry bath for boil preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89047-208</td>
			<td>2 mm electroporation cuvettes with round cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>940000009</td>
			<td>110 VAC, 60 Hz electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP102-1</td>
			<td>Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA-EM4050</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>GB0217</td>
			<td>For the preparation of selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33</td>
			<td>Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1352-0000</td>
			<td>Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-690-550D</td>
			<td>Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>Streaking colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation spreader</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1569.005</td>
			<td>Spreading of culture onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) broth, Lennox</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1427</td>
			<td>Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S67601B</td>
			<td>Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>10090</td>
			<td>For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td>Mandel</td>
			<td>Various</td>
			<td>Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645050</td>
			<td>PowerPac Basic power supply for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 &#956;M as directed on the product specification sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>SB0498</td>
			<td>For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>T-500</td>
			<td>PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Model T100 for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S24559</td>
			<td>For patching colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZLXLSD51040</td>
			<td>MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide range DNA marker</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>M103R-2</td>
			<td>Size determination of PCR products on an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden inoculating sticks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-801-02</td>
			<td>Inoculating cultures with colonies from agar plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multidrug efflux systems in acinetobacter baumannii using an efflux&#45;deficient bacterial strain and a single&#45;copy gene expression system

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )는 항생제에 대한 광범위한 내성으로 인해 까다로운 그람 음성 병원체로 인식되고 있습니다. 새롭고 효과적인 치료 옵션을 설계하기 위해 이러한 내성 이면의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 불행히도, A. baumannii 에서 이러한 메커니즘을 조사할 수 있는 우리의 능력은 적절한 유전자 조작 도구의 부족으로 인해 방해를 받고 있습니다. 여기서, 우리는 기능적 RND 유형 유출 메커니즘이 결여된 A. baumannii 균주에서 단일 복제 유전자 발현을 달성하기 위해 염색체 mini-Tn7 기반 시스템을 활용하는 방법을 설명합니다. single-copy insertion 및 inducible efflux pump 발현은 매우 유리한데, 이는 high-copy number plasmid에서 RND efflux operon의 존재가 종종 박테리아 세포에 의해 잘 견디지 못하기 때문입니다. 또한, 재조합 mini-Tn7 발현 벡터를 향상된 유출 민감도를 가진 대리 A. baumannii 숙주의 염색체에 통합하면 다른 유출 펌프의 간섭을 우회하는 데 도움이 됩니다. 이 시스템은 특성화되지 않은 박테리아 유출 펌프를 조사할 뿐만 아니라 이러한 펌프를 표적으로 하는 잠재적 억제제의 효과를 평가하는 데에도 유용합니다.

Acinetobacter baumannii is a World Health Organization top priority pathogen due to its encompassing resistance to all classes of antibiotics1. It is an opportunistic pathogen mostly affecting hospitalized, injured, or immunocompromised people. A. baumannii largely evades antibiotics via efflux pumps, the most relevant being the Resistance-Nodulation-Division (RND) family of exporters2. Understanding how these efflux pumps work mechanistically will allow one to develop targeted therapeutic options.
One common way that cellular processes can be specifically distinguished is through genetic manipulation. However, the tools available for A. baumannii genetic studies are limited, and to further confound experimental design, clinical isolates often are resistant to the antibiotics routinely used for selection in genetic manipulations3. A second hurdle encountered when studying efflux pumps specifically is that they are strictly regulated-often by unknown factors-making it difficult to accurately isolate and attribute function to a single pump4. Seeing this need to expand the research toolbox, we developed a mini-Tn7-based, single-copy-insertion, inducible expression system that incorporates a Flp recombinase target (FRT) cassette, which allows for the removal of the selection marker5,6,7 (Figure 1). First created for Pseudomonas8,9,10, this elegant cloning and expression system was used to generate single-copy efflux pump complements into an RND efflux pump-deficient strain of A. baumannii (ATCC 17978::&#916;adeIJK,&#916;adeFGH,&#916;adeAB: hereafter referred to as A. baumannii AB258) that we generated11. Being able to study one efflux pump at a time and not overwhelm the bacterial cells with high-copy expression (as generally seen with plasmid-based expression systems), one can better learn about the critical, physiological aspects of each efflux pump with minimal interference and reduced complications.
This article describes how to use the mini-Tn7 system to complement a deleted gene of interest, RND efflux pump adeIJK, into the chromosome of A. baumannii AB258 through a series of uncomplicated steps performed over the course of 9 days7. The first set of steps re-introduces the deleted efflux pump genes cloned into the mini-Tn7-based insertion plasmid (Figure 2A) at the single attTn7 insertion site downstream of the well-conserved glmS gene (Figure 3A). This process is facilitated by a non-replicative helper plasmid (Figure 2B) that encodes for the transposase genes needed for Tn7-driven insertion. The second set of steps uses an excision plasmid (Figure 2C) for Flp recombinase-mediated removal of the gentamicin gene flanked by FRT sites (Figure 3B) to create an unmarked strain. Though this system is used to elucidate the essential roles and possible inhibitors of RND efflux pumps with respect to antibiotic resistance, it can be used to investigate any gene of interest.

저자 스포트라이트: Advancing Antibiotic Resistance Research Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System (유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 항생제 내성 연구 발전)

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

We study multi-drug resistance efflux systems in gram-negative bacteria. We are interested in learning about the natural functions of these pumps and how these pumps can be used as a potential drug target. Expression of multi-drug resistance efflux systems is tightly regulated, making it difficult to study their functions.Thus, an expression system that bypasses the regulatory system can be quite useful in the characterization of these pumps. This protocol allows for the expression of genes at levels usually seen in natural settings. Thus, the activity of the gene products mimics what is observed in nature.

염색체 삽입 절차는 선택적 한천 플레이트에서 자라는 결과 콜로니를 확인하는 데 3일 동안 총 2시간밖에 걸리지 않습니다(그림 1A-C). 형질전환 플레이트에서 예상되는 콜로니의 수는 균주에 따라 달라진다: attTn7 부위에 Tn7을 삽입하는 것이 특이적이고 효율적이기 때문에 20-30개 또는 수백 개의 콜로니를 볼 수 있다9. 형질전?...

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우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

우리는 그람 음성 박테리아에서 다중 약물 내성 유출 시스템을 연구합니다. 우리는 이러한 펌프의 자연적인 기능과 이러한 펌프가 잠재적인 약물 표적으로 사용될 수 있는 방법에 대해 배우는 데 관심이 있습니다. 다제내성 유출 시스템의 발현은 엄격하게 조절되어 기능을 연구하기가 어렵습니다.따라서 조절 시스템을 우회하는 발현 시스템은 이러한 펌프의 특성화에 매우 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 자연 환경에서 일반적으로 볼 수 있는 수준의 유전자 발현을 허용합니다. 따라서 유전자 산물의 활동은 자연에서 관찰되는 것을 모방합니다.

characterizing-multidrug-efflux-systems-acinetobacter-baumannii-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

352 조회수.  University of Manitoba. 우리는 그람 음성 박테리아에서 다중 약물 내성 유출 시스템을 연구합니다. 우리는 이러한 펌프의 자연적인 기능과 이러한 펌프가 잠재적인 약물 표적으로 사용될 수 있는 방법에 대해 배우는 데 관심이 있습니다. 다제내성 유출 시스템의 발현은 엄격하게 조절되어 기능을 연구하기가 어렵습니다.따라서 조절 시스템을 우회하는 발현 시스템은 이러한 펌프의 특성화에 ...

비디오: 저자 스포트라이트: Advancing Antibiotic Resistance Research Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System (유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 항생제 내성 연구 발전)

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.