J. 추아, D. 차봇, A. 프리들랜더는 원고에 설명된 절차를 설계했다. J. 추아와 T. 퍼트몬 테일러는 실험을 수행했다. D. Chabot은 데이터 분석을 수행했습니다. 제이 추아는 원고를 썼다.
저자는 우수한 기술 지원을 카일 J. Fitts 감사합니다.
이 작업은 국방 위협 감소 국 보조금 CBM에 의해 지원되었다. VAXBT.03.10.RD.015, 계획 번호 921175.
의견, 해석, 결론 및 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 이 출판물의 내용은 반드시 국방부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급은 미국 정부의 지지를 의미하지도 않습니다.

동물 복지법, 공중 보건 서비스 정책 및 동물과 관련된 기타 연방 법령 및 규정에 따라 여기에 설명 된 연구는 기관 동물 관리 및 사용위원회 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구가 수행 된 시설은 국제 실험실 동물 관리협회의 인증을 받았으며 실험실 동물의 치료 및 사용 가이드, 국립 연구 위원회, 201124에명시된 원칙을 준수합니다.
1. 세포주 배양 및 유지 보수, RAW 264.7
참고: 무균 기술로 다음 절차를 수행해야 합니다.
<ol><li>56°C 수조에서 태아 소 혈청(FBS)을 30분 동안 가열하여 보완합니다. 참고: FBS가 56°C에 도달하면 30분의 비활성화 시간이 시작됩니다. 온도를 모니터링하려면 동일한 수조의 비커에 비슷한 양의 물을 가열합니다. 물이 56°C에 도달하면 FBS에 대한 30분 카운트다운을 시작합니다. 또는 열 비활성화된 FBS도 시판됩니다.</li>
	<li>90% DMEM과 높은 포도당 및 10% 열 비활성화 FBS(v/v)를 결합하여 RAW 264.7 세포에 대한 배지를 준비한다. L-글루타민을 6mM의 최종 농도에 추가합니다. 참고 : 높은 포도당DMEM은 4 mM L-글루타민으로 제조됩니다. L-글루타민을 6mM로 보충하는 것은 일관된 세포 성장을 촉진합니다. 100 U/mL 페니실린 과 100 μg/mL 연쇄 절제술은 오염을 방지하기 위해 첨가될 수 있다. 또 다른 일반적인 뮤린 세포주, J774A.1, 또한 사용 될 수 있으며 유사한 조건하에서 성장.</li>
	<li>37°C 수조에서 냉동 된 세포 유리병을 해동하고 녹자마자 욕조에서 제거하십시오. 원적 튜브에 5mL 완성 매체에 무균으로 내용을 추가합니다. 원추형 튜브를 두 번 반전시키고 300 x g에서 펠릿 세포까지 5분 동안 회전합니다.</li>
	<li>진공에 부착된 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 흡인 매체를 사용하여 동결제를 제거합니다. 신선한 배지의 5mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>플라스크 또는 접시를 치료한 조직 배양으로 현탁액을 옮기. 플라스크의 바닥을 완전히 덮고 세포를 균등하게 분배할 수 있는 충분한 매체를 추가합니다. "1"로 시작하는 통로 번호를 나타냅니다.</li>
	<li>37°C에서 세포를 배양하여 5% CO2의 존재와 습도가 95% ~ 100% 연결성에 도달한다. 인큐베이션의 둘째 날부터 현미경으로 매일 세포를 확인하십시오. 세포가 들어 올리고 죽게 하기 때문에 세포가 도달하도록 허용하지 마십시오.gt;100% 합류. 참고: 합류에 도달하는 데 필요한 시간은 얼마나 많은 라이브 세포가 도금되었는지, 플라스크의 성장 영역에 따라 달라집니다. 따라서, 매일 세포를 확인하는 것이 신중하다.</li>
	<li>스크레이핑 사이에 적어도 이틀간의 성장을 허용하는 신선한 배지에서 세포 육수를 긁고 희석하여 서브배양 세포. 각 하위 문화권에서 통로 수를 1로 늘립니다. 참고: 다음 날 통과되고 즉시 긁으면 시간이 지남에 따라 일반 셀 준수가 더 빨라집니다. RAW 264.7 셀은 대략 15항까지만 사용해야 한다.</li>
	<li>OAA 분석에 대 한 RAW 264.7 세포를 플레이트하려면, 신선한 매체로 교체 하 고 부드럽게 플라스크에서 세포를 긁어 세포 를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용 하 여. 파이펫을 위아래로 분해하여 세포 응고를 쉽게 만듭니다. 참고: RAW 264.7을 세분화하는 기존의 방법은 긁어내는 것입니다. 우리의 경험에서 트립신을 사용하면 RAW 264.7 셀이 긁는 것보다 시간이 지남에 따라 준수를 잃게됩니다.</li>
	<li>셀을 계산하려면 동일한 양의 셀과 trypan blue 용액을 희석합니다. 혈류계에 10 μL을 적재합니다. 10배 객관적렌즈를 사용하여 반전된 복합 현미경을 사용하여 염료를 배제하는 살아있는 세포의 수를 관찰하고 계산한다.</li>
	<li>플레이트 1.4 x 104 96 에서 잘 당 실행 가능한 셀 0.15 μm 두께의 유리 평면 바닥 플레이트 (플레이트 #1). 세포가 3일 동안 성장할 수 있도록 합니다. OAA를 수행하기 전에 하루 동안 소비된 매체를 교체하십시오. 참고: 3일 간의 인큐베이션 후 셀 수는 약5 x 10 4/well이어야 합니다.</li>
</ol>2. 세균 문화와 준비
참고 : 이 프로토콜에 사용되는 세균성 종은 캡슐화된 악성 균주, B. 탄트라시스 에임스입니다. 이 종과의 모든 조작은 적절한 생체 안전 및 보안 허가를 필요로하며 BSL-3 실험실에 위치한 클래스 II 또는 클래스 III 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. BSL-3 작업에 대한 제도적 운영 절차를 따르고 박테리아를 취급할 때 개인 보호 장비를 사용할 수 있습니다.
<ol><li>1L물에 37g BHI 분말을 용해하고 15분 동안 121°C에서 오토클레이브하여 뇌 심장 주입(BHI) 국물을 준비합니다. 주변 온도에서 국물을 저장합니다.</li>
	<li>물에 8% 중탄산나트륨 용액을 준비하고 0.20 μm 필터 주사기를 사용하여 살균한다. 용액을 4°C로 저장하고 1일 이내에 사용하십시오.</li>
	<li>영양 국물 8g, 효모 추출물 3g, 15g의 한마고를 1L 물에 섞어 NBY 한천 판을 준비합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브. 페트리 접시에 붓고 굳어두는 다. 4 °C에서 접시를 보관하십시오. 참고: NBY 한천 플레이트는 중탄산나트륨 유무에 관계없이 만들 수 있습니다. 국물 및 한천 판에 중탄산나트륨을 첨가하여 캡슐화된 바실리로 구성된 점막 식민지의 성장을 유도한다. 액체 및 고체 매체 모두에서 중탄산나트륨의 최종 농도는 0.8%입니다.</li>
	<li>50% 오토클레이브 BHI 국물, 40% FBS 및 10% 중탄산나트륨 용액(v/v)을 혼합하여 B. 탄트라시스에 대한 배양 국물을 준비합니다. 참고 : 이 국물은 캡슐화된 바실리의 짧은 사슬을 생성하도록 제조되었습니다.</li>
	<li>물자에서 배양하기 하루 전에 포자 스톡에서 NBY 한천 접시에 절연을 위해 줄무늬로 B. 탄트라시스의 마스터 플레이트를 준비합니다. 37 °C에서 인큐베이션.</li>
	<li>B. 탄트라시스의여러 식민지와 환기 250 mL 플라스크에서 문화 국물의 30 mL 접종. 참고: 여기에 명시된 바와 같이 국물의 표면 비에 대한 특정 부피는 최대 캡슐화된 바실리를 생성하기 위해 필요합니다.</li>
	<li>국물 배양을 125rpm, 37°C에서 20% CO2, 습도 18-24h로 흔들어 주세요. 참고: 37°C 이상의 온도에서 B. 탄트라시스가 증가하여 캡슐 생산을 저해할 수 있습니다.</li>
	<li>충분한 캡슐화를 보장하기 위해 인도 잉크와 부정적인 염색을 사용하고 바실리가 고정하기 전에 짧은 사슬 (1-5 bacilli / 체인)에 있습니다 (섹션 3 참조).</li>
	<li>식민지 형성 단위 (CFU)를 결정하기 위해, 연속적으로 배양 100 μL을 희석 1:10 인산염 완충식 식염수 (PBS) 용액 및 양 혈액 천막 판에 플레이트 배양 희석. 37°C에서 12-18h의 인큐베이션을 사용할 수 있습니다. CfUs를 계산하고 문화의 mL 당 박테리아의 수를 결정합니다. 참고: 박테리아가 고정되면 현미경의 밑에 혈종계를 사용하여 계산은 또한 수행될 수 있습니다. 그러나, 이것은 바실리가 낮은 배율하에서 보기 어렵기 때문에 권장되지 않습니다.</li>
	<li>16% 파라포름알데히드(PF)를 세균 배양의 전체 부피에 4% PF의 최종 농도로 첨가하여 바실리를 고치게 한다. 7일 동안 주변 온도에서 셰이커를 천천히 동요합니다. 참고: 4% PF에서 7일간의 인큐베이션은 식물성 간균 을 고정하기 위한 USAMRIID 제도적 표준 운영 절차를 기반으로 합니다.</li>
	<li>멸균에 대한 고정 및 테스트를 제거하기 위해 50mL 원심관에서 고정 세균 서스펜션의 4mL(10% 부피)을 45분 동안 ≥3000 x g에서 원심분리하고 PBS로 30mL/wash를 사용한다. 나머지 샘플을 4°C에서 4% PF에 저장합니다. 참고 : 펠릿 후, 세균성 펠릿은 캡슐의 존재로 인해 푹신푹신합니다. 세탁 하는 동안 펠 릿을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 실행 가능성 테스트를 방해하지 않도록 모든 고정을 제거해야합니다. 필요한 경우 세하 수를 늘립니다.</li>
	<li>생존성 검사를 위해, 4mL의 세척현탁액(국물량의 ≤ 10%)을 가진 세균성장 배지(예를 들어 BHI 국물)의 40mL를 접종하고 7일 동안 37°C에서 배양한다. 탁도를 측정하기 위해 7일 전후 600nm에서 광학 밀도를 확인합니다.</li>
	<li>국물 배양 7일 후, 접시≥100 μL의 국물을 한천판에 ≥ 7일 동안 배양한다. 탁도가 증가하지 않고 플레이트에 대한 성장이 보이지 않으면 원래 배양은 멸균으로 간주되며 BSL-2 실험실로 옮겨질 수 있습니다. 참고: 연방 선택 에이전트프로그램(22)은 불활성화된 B. 탄트라시스가 샘플의 완전한 멸균을 입증한 후에만 BSL-3 실험실에서 전송될 수 있음을 규정하고 있습니다. 불활성화 된 B. 탄트라시스에 대한 생존 성 테스트는 7 일 동안 국물에 있는 샘플의 10 %를 배양한 다음 7 일22,23일 다른 고체 배지에서 배양하는 것으로 구성됩니다. 불임이 확립되면 기관 지침을 따라 이전 승인을 받을 수 있습니다.</li>
</ol>3. 캡슐화 및 간실리 사슬을 관찰하는 부정적인 염색 및 가벼운 현미경 검사법
<ol><li>5 μL 세균 현탁액을 현미경 슬라이드에 인도 잉크 2 μL과 혼합합니다. 거품을 만들지 않고 서스펜션 위에 1 또는 1.5 μm 두께의 커버 글래스를 놓습니다. 참고: 매니큐어는 커버 글래스를 슬라이드에 밀봉하는 데 사용될 수 있습니다.</li>
	<li>가벼운 현미경에서 40x 에서 100x 오일 객관적 렌즈를 사용하여 세균 현탁액을 관찰하십시오. 각 박테리아를 둘러싼 클리어런스 영역(캡슐제외 인도 잉크)을 관찰하고 박테리아 사슬이 짧다는 것을 바실리가 캡슐화되었는지 확인하십시오.</li>
</ol>4. 박테리아의 FITC 라벨링
<ol><li>2 mg/mL의 농도로 디메틸 설프리산화물에 형광균 이소티오야네이트(FITC)를 용해하십시오.</li>
	<li>불활성화 된 세균 재고의 양을 측정합니다.</li>
	<li>PBS에서 스톡을 3배 세척하여 고정을 제거합니다.</li>
	<li>75 μg/mL의 최종 농도에서 FITC 솔루션을 추가합니다. 4°C에서 18-24h의 혼합물을 천천히 동요합니다.</li>
	<li>세 번 ≥3000 x g, 45 분에서 펠릿과 30 mL PBS / 세척을 사용하여 과도한 FITC를 제거하여 박테리아를 씻으십시오. 푹신한 펠릿이 세탁 중에 방해받지 않도록 하십시오. 동일한 시작 볼륨에서 PBS에서 바실리를 다시 중단합니다.</li>
	<li>Aliquot 및 사용 전까지 -20°C의 마이크로튜브에 바실리를 저장합니다. 바실리가 캡슐을 잃을 수 있기 때문에 바실리를 여러 번 동결/해동하지 마십시오.</li>
</ol>5. 세균 성 편화
<ol><li>열은 열 블록에서 30 분 동안 56 °C에서 소량의 테스트 세라 (NHP에서)를 비활성화합니다.</li>
	<li>3-5 분 동안 15000 x g에서 펠릿하여 PBS 2x로 FITC 라벨박테리아를 해동하고 세척하십시오. PBS에서 동일한 시작 볼륨으로 다시 일시 중지합니다.</li>
	<li>96웰 원형 바닥 플레이트(플레이트 #2)에서, 세포 배지에서 연속적으로 테스트 세라를 희석시. 또 다른 96 개의 잘 둥근 바닥 플레이트 (플레이트 #3)에서 각 우물에 희석 된 테스트 세라 10 μL을 추가하십시오. 참고 : 모든 접시에서 PBS와 일반 원숭이 세라가 희석 된 테스트 세라 대신 에 포함되었습니다. 또한 하나의 테스트 세럼을 긍정적인 컨트롤로 선택하여 다른 날에 수행된 모든 분석방법을 정규화하는 표준 곡선을 생성했습니다. 양성 제어 테스트 혈청은 풍부했기 때문에 임의로 선택되었습니다.</li>
	<li>플레이트 #3 10 μL 갓 재구성된 아기 토끼 를 추가하십시오. 참고: 일단 재구성되면 남은 아기 토끼 를 폐기하십시오. 재고정 및 해동하지 마십시오.</li>
	<li>플레이트 #3, 1:20의 감염의 복합성에 대한 FITC 라벨 바실리의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어 5 x 104 x 20 바실리를 포함하는 부피를 5 x 104 세포에 추가합니다. 총 105 μL에 셀 배지의 적절한 부피와 #3 플레이트에서 각 우물을 위로. 참고: 세포를 포함하는 플레이트 #1, 빈 부피로 나머지 5 μL와 함께 공손화 된 박테리아의 100 μL을 수신합니다. 우리는 테스트 세라의 각 희석을 복제하여 테스트했습니다.</li>
	<li>37°C에서 30분 동안 30분 동안 배양판이 #3 습도가 있는CO25%의 존재하여 바실리를 오손화한다.</li>
</ol>6. 포유류 세포의 준수 분석 및 형광 라벨링
<ol><li>사용하기 전에 모든 시약을 37 °C에서 유지하십시오.</li>
	<li>37°C 열 블록에 부착 셀이 포함된 플레이트 #1 놓습니다.</li>
	<li>멀티채널 피펫터를 사용하여 우물에서 소비된 매체를 제거하고 플레이트 #3 100 μL의 공진균으로 빠르게 교체하십시오. 파이펫팅 중에 우물에서 거품이 생성되지 않았는지 확인합니다. 인큐베이션 플레이트 #1는 37°C에서 5% CO2, 습도가 30분 동안 준수합니다.</li>
	<li>37°C 열 블록 위에 150 μL PBS로 각 우물 5배를 세척하여 부착되지 않은 바실리를 제거합니다. 참고: 세척 중에 셀이 실수로 분산되지 않도록 주의해야 합니다.</li>
	<li>PBS 1:4로 16% PF를 희석하여 4% PF를 만듭니다. 각 웰에 150 μL을 추가하여 1h에 4% PF로 셀을 수정합니다. PBS로 셀 2배 세척.</li>
	<li>10mL PBS에 2 μL HCS (고함량 스크리닝) 오렌지 셀 스테인을 혼합합니다. 이 염색 용액의 150 μL을 고정 된 세포에 추가하고 주변 온도에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>PBS로 우물 2배 세척.</li>
	<li>현미경 검사법까지 4 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>7. 현미경 검사법
참고: 일반적으로 고처리량 자동 형광 현미경은 OAA에 대한 이미징을 용이하게 합니다. 자동화 된 시스템을 사용할 수없는 경우, 부착 된 간실리의 형광 이미지는 수동으로 촬영 할 수있다21. 본연구에서는 20,부착된 바실리 및 세포 단층은 특수 장비를 갖춘 자이스 700 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용하여 이미지화되었다; 우리의 시스템은 자동화 된 단계, 명확한 초점 모듈, 40 x NA 0.6 목표, 악시오 캠 HRc 카메라와 젠 2012 (블루 에디션) 소프트웨어가 장착 된 자이스 악시오 옵저버 Z1 반전 현미경으로 구성되었다. 획득한 이미지는 공초점 이미지가 아닌 와이드필드 이미지입니다. 다음 프로토콜은 다양한 자동화 된 현미경 시스템에 적용되는 기본 현미경 설정으로 설계되었습니다.
<ol><li>30 분 동안 주변 온도에서 #1 인큐베이션 플레이트. 현미경 및 관련 장비를 켭니다. 참고: 주변 온도에서 의적응하면 이미징 중에 유리 판에 응축이 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 온도 변화로 인한 디포커싱을 방지합니다.</li>
	<li>스테이지에 플레이트를 놓고 밝은 필드 또는 위상 대비를 사용하여 세포에 집중하십시오.</li>
	<li>플레이트 설정으로 96의 잘 포맷을 선택합니다. 채널 설정을 선택합니다. 참고: FITC의 피크 여기 및 방출 파장495/519 nm; HCS 오렌지 셀 얼룩은 556 및 572 nm입니다. 다른 형광은 현미경에서 사용할 수있는 필터에 따라 사용될 수있다.</li>
	<li>타일 모드로 설정을 선택합니다. 획득할 이미지 수를 나타냅니다. 참고: 타일링 기능을 사용하면 샘플에서 여러 위치를 잘 캡처할 수 있으며 타일 또는 임의 형식으로 이미지를 획득하도록 설정할 수 있습니다. 우리는 잘 당 10 임의의 영역을 이미지.</li>
	<li>획득 모드를 "흑백" 또는 "흑백" 또는 비닝 ≥ 2x2로 변경합니다. 참고: 비닝을 1x1에서 2x2 또는 4x4로 설정하면 미세 검사 속도가 빨라지지만 이미지해상도도 낮아집니다. OAA의 경우, 분석이 대식세포와 부착박테리아를 모두 내포할 때 이러한 설정을 사용하기에 충분합니다.</li>
	<li>자동 초점 또는 초점 모듈을 켭니다. 자동 초점 조정 함수를 수행하는 빈도를 나타냅니다. 사용 가능한 경우 Z 스택 기능을 켭니다. 세포 단층 및 부착 된 바실리의 두께를 캡처 할 Z 스택의 수를 나타냅니다. 참고: 선택한 Z 스택의 수는 현미경 검사법을 증가하지만 각 Z 스택에서 올바른 초점을 가진 이미지를 촬영합니다.</li>
	<li>이미지를 저장할 파일 폴더를 지정합니다. 자동화된 이미징 프로그램을 실행합니다.</li>
</ol>8. 데이터 수집 및 분석
<ol><li>이미지당 부착된 바실리 및 포유류 세포의 수를 계산합니다. 간균의 각 사슬을 하나의 박테리아로 계산합니다.</li>
	<li>적절한 통계 프로그램에서 표준 곡선을 생성하기 위해 양성 대조군 시험 혈청 및 티터(예를 들어, 1:10 희석은 10티터 단위)의 바실리/세포를 플롯한다.</li>
	<li>비선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 양수 제어 테스트 세럼을 분석합니다. 그런 다음 양수 제어 테스트 혈청의 표준 곡선을 사용하여 나머지 샘플을 분석하여 해당 티터를 결정합니다. 참고: 일반적으로 티터를 결정할 때 표준 곡선의 중간 부근에 있는 샘플 희석을 선택하는 것이 가장 정확합니다.</li>
	<li>각 백신 그룹에서 샘플의 기하학적 평균을 계산합니다. ANOVA 분석의 가장 큰 차이로 로그 변환 된 티터의 P-값을 계산합니다.</li>
</ol>

<ol>
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Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf">https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf</a> (2011)</li><li>Durando, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+with+pneumococcal+polysaccharide+conjugate+vaccine+(conjugated+to+CRM197+carrier+protein)+in+children+and+adults.">Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults.</a> Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).</li><li>Adams, W. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chua, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+reprograms+waves+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+on+phagosomal+organelles.">Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).</li><li>Chua, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+Alkalinization+by+Chloroquine+Suppresses+Pathogenic+Burkholderia+Type+6+Secretion+System+1+and+Multinucleated+Giant+Cells.">pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells.</a> Infection &amp; Immunity. 85 (1), (2017).</li><li>Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+promiscuity+for+antibody-FcRn+interactions+across+species:+implications+for+therapeutic+antibodies.">Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies.</a> International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).</li><li>Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibodies+use+complement+to+regulate+antibody+responses.">How antibodies use complement to regulate antibody responses.</a> Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).</li><li>Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+routine+opsonophagocytosis+assay+to+predict+invasive+pneumococcal+disease+efficacy+of+conjugate+vaccine+in+children.">Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children.</a> Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).</li><li>Wolf, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).</li></ol>

저자는 이해 상충을 야기할 수 있는 상업적 또는 기타 협회가 없습니다.

캡슐 계 백신은 수많은 세균 성 병원균에 대해 효과적인 것으로 나타났으며, 많은 사람들이 인간25,26,27에서사용하기 위해 허가된다. 이들 백신은 캡슐을 표적으로 하는 항체를 생성함으로써 작용하며 이들 연구의 대부분은 OPKA를 사용하여 항체13,14, 16,<...

병원체의 인식, 준수, 내재화 및 분해는 1883년 일리아 메치니코프가 처음 기술한 숙주 인내 면역 반응에서 현저한 통로인식세포증1,3에 필수적이다. 면역 계통의 그밖 세포뿐만 아니라 식세포 백혈구는 표적의 그들의 선택에 있는 높게 차별적입니다; 그들은 패턴 인식 수용체 (PRR)4,5의레퍼토리에 의해 병원균 관련 분자 패턴을 통해 "전염성 비 자기"와 "비 감염성 자아"를 구별 할 수 있습니다. 병원체의 숙주 인식은 또한 보완 및 항체6과같은 숙주 opsonins의 결합으로 발생할 수 있다. opsonization에게 불린 이 프로세스는, phagocytic 세포에 opsonic 수용체 (예를 들면, 보충 및 Fc 수용체)에 결합시 내성을 강화하는 이 분자로 병원체를 코팅합니다6. 병원체가 식세포에 부착하려면, 그들의 cognate 리간드와 다중 수용체의 집단 결합이 필요하다. 그런 다음에야 내산화6을 시작하기 위해 호스트 셀 내부의 신호 캐스케이드를 트리거하고 유지할 수있습니다.
병원균의 허가와 감염 예방에 있는 phagocytosis의 중요성 때문에, 세포외 병원체는 그들의 생존을 연장하기 위하여 이 과정을 전복하는 수많은 쪽을 개발했습니다. 중요도의 한 가지 전략은 음이온 중합체(예를 들어, 다당류 또는 폴리아미노산) 캡슐의 생산으로, 그 전하에 의한 항식세포이며, 면역성이 좋지 않으며, PRRs6,7로부터세균용 봉투에 분자를 보호한다. Cryptococcus neoformans 및 연쇄상 구균 폐렴과 같은 병원체는 사카라이드 폴리머로 구성된 캡슐을 가지고 있는 반면, 황색포도상구균 표피증 및 일부 바실러스 종은 폴리 ɣ 글루타믹 산 (PGGA)7,8을생산한다. 그러나 그밖 병원체는 비 전염성 자기를 닮은 캡슐을 생성합니다. 예를 들어, 연쇄상구균 표겐과 B. 세레우스의 병원성 균주는 항식세포뿐만 아니라 면역계통9,10에의해 외국으로 인식되지 않을 수 있는 히알루론산 캡슐을 갖는다.
캡슐을 운반대 단백질로 유도하여 가난한 T-독립적인 항원에서 높은 혈청 항체 티터를 유도할 수 있는 면역성 T 의존성 항원으로 변환한다11,12. 이 전략은 S. 폐렴, 혈우병 인플루엔자, 니세리아 수막기티드11에대한 허가된 백신에 사용된다. 항체의 opsonic 활동은 일반적으로 opsono-phagocytic 살인 분석서(OPKA)13,14,15,16에의해 평가되었다. 이러한 작용성 항체가 식세포증을 유발하고14명을죽일 수 있는지 여부를 테스트합니다. 그러나, B. 탄트라시스17을포함하여 Tier 1 생물학 선택 에이전트 및 독소 (BSAT)와 같은 전염성 병원체를 가진 OPKA의 사용은 위험하고 보안 위험을 제시합니다; 이러한 에세이는 선택 에이전트의 광범위한 처리가 필요합니다. 선택 에이전트 처리는 제한된 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서만 수행 할 수 있습니다; 이러한 분야에서의 업무는 따라야 할 수많은 안전 및 보안 예방 조치로 인해 장기간 운영 절차를 요구합니다. BSL-3 실험실은 또한 현미경 및 세포계와 같은 OPKA 작업에 사용되는 특수 장비를 전형적으로 갖추지 않습니다. 따라서, 우리는 불활성화박테리아(18),19의사용에 기초하여 대안적 분석체를 개발하였다. 우리는 이것을 내면화와 살인에 의존하지 않는 opsono 준수 분석 (OAA)로 지칭합니다. 대신, 편화불활성 병원균의 준수는 식세포증의 지수로 사용된다. 기계적으로, OAA는 준수가 선견자를 발생하고 내재화 및 세포 내 살인과 밀접하게 얽혀 있기 때문에 적합한 대체품입니다. 생물안전적 관점에서, OAA는 전염하는 제제의 최소한의 취급이 필요하고, OPKA보다 더 짧은 지속 시간의 실험적이며, 불활성화 된 병원체의 재고가 생산및 옮겨진 후 BSL-2 실험실에서 수행 될 수 있기 때문에 선호된다.
우리는 캡슐 공주게이트로 예방 접종된 비인간 영장류(NHP)의 혈청에서 발견되는 항체의 opsonic 기능을 검사하기 위해 OAA의 활용을 입증한다[즉, B. 탄트라시스로부터 PGGA] 네이세리아 수막의외부 막 단백질 복합체(OMPC)에 공각]20. 혈청 협소화 된 바실리는 부착 된 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 배양되었다. 고정 후, 세포 단층 및 부착 된 바실리는 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 세균성 준수는 세균성 준수가 대조군혈청(20)에비해 캡슐 컨쥬게이트로 예방 접종된 NHPs로부터 혈청으로 배양되었을 때 증가하였다. 탄집 도전20,21의생존과 상관 관계가 있는 준수. 따라서, OAA의 사용은 항체항체의 기능을 특징으로 하고 백신 후보의 시험을 크게 촉진시켰다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.20 &#181;m syringe filter (25mm, regenerated cellulose)</td>
			<td style="width:483px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:267px;">431222</td>
			<td style="width:391px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mL syringe (Luer-Lok tip)</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15&#181; 96 well black plates (plate #1 for imaging)</td>
			<td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td>
			<td>P96-1-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">75 cm sq. tissue culture treated flask</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Baby Rabbit Complement</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td>
			<td>CL3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates</td>
			<td>Remel, Lenexa, KS</td>
			<td>R01198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt, Newton, NC</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Costar 96 well cell culture plates (plates #2 &#38; 3 for dilutions)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>72200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Difco Nutrient Broth</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>234000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope)</td>
			<td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>not gamma irradiated, not heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>F143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>H32713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hemocytometer (Improved Neubauer)</td>
			<td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td>
			<td>3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">India Ink solution</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>261194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L- glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td>
			<td>25030081</td>
			<td>supplement medium with additional 2mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope)</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS without Calcium or Magnesium</td>
			<td>Lonza, Walkersville, MD</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petri dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon, Corning, Durham, NC</td>
			<td>351029</td>
			<td>for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47)</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td>
			<td>4109001865956000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsono-adherence assay to evaluate functional antibodies in vaccine development against bacillus anthracis and other encapsulated pathogens

opsono 준수 분석법은 전문 식세포에 세균성 병원체의 부착을 열거하는 기능성 분석입니다. 준수는 phagocytosis와 살인에 필수이기 때문에, 분석법은 opsono-phagocytic 살인 분석의 대안 방법입니다. opsono 준수 분석의 장점은 여러 실험에 걸쳐 표준화를 허용하는 불활성화 된 병원체 및 포유류 세포주를 사용하는 옵션입니다. 분석에서 불활성화 된 병원체의 사용은 또한 생물 안전 수준 3 전염성 요원 및 기타 악성 병원균과 함께 작동을 용이하게합니다. 우리의 작업에서, opsono 준수 분석체는 탄저병 캡슐 기지를 둔 백신으로 면역화된 동물의 세라로부터 항체의 기능적 능력을 평가하기 위해 사용되었으며, 고정 된 바실러스 탄트라시스의 부착을 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 유도하는 데 사용되었습니다. 자동 형광 현미경 검사는 대식세포에 고부딩하는 바실리의 이미지를 캡처하는 데 사용되었습니다. 증가된 준수는 혈청에 있는 항체 항체의 존재와 상관관계가 있었다. 높은 혈청 항체 항체 농도를 전시한 비인간 영장류는 탄탈병 도전으로부터 보호되었다. 따라서, opsono-준수 분석체는 세라에서 항원 특이적 항체의 생물학적 기능을 해명하고, 백신 후보 및 기타 치료제의 효능을 평가하고, 면역의 가능한 상관관계로서 작용할 수 있다.

이 섹션은 OAA가 항체의 생물학적 기능을 검사하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 결과와 함께 OAA 실험 중에 수집된 대표적인 현미경 사진을 보여줍니다. 여기서, 분석은 탄집병 백신 후보의 효능을 평가하기 위해 성공적으로 사용되었다. 캡슐화가 거의 또는 전혀 캡슐화되지 않아 숙주 세포를 고수하여 높은 배경을 생성하는 바실리에 캡슐화 상태를 확인하는 것이 중요합니다. 도 ...

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Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

opsono-준수 분석법은 백신 개발에서 항체의 opsonic 기능을 평가하기 위한 opsono-phagocytic 살인 분석법에 대한 대안적 방법입니다.

바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

opsono-adherence-assay-to-evaluate-functional-antibodies-vaccine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

3.3K 조회수.  United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. opsono-준수 분석법은 백신 개발에서 항체의 opsonic 기능을 평가하기 위한 opsono-phagocytic 살인 분석법에 대한 대안적 방법입니다.

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

연구

면역학 및 감염병학

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 장 소기관을 사용 하 여 살 모 넬 라 및 기타 병원 균에 대 한 상피 세포 보호 연구 및 수정

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are limited. In addition, they exhibit adverse side effects in certain groups of people. Therefore, discovery of novel therapeutics for clinical toxoplasmosis is imperative. The first step of novel antibiotic development is to identify chemical compounds showing high efficacy in inhibition of parasite growth using a high throughput screening strategy. As an obligate intracellular pathogen, Toxoplasma can only replicate within host cells, which prohibits the use of optical absorbance measurements as a quick indicator of growth. Presented here is a detailed protocol for a luciferase-based growth assay. As an example, this method is used to calculate the doubling time of wild-type Toxoplasma parasites and measure the efficacy of morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, a cysteine protease-targeting compound) regarding inhibition of parasite intracellular growth. Also described, is a CRISPR-Cas9-based gene deletion protocol in Toxoplasma using 50 bp homologous regions for homology-dependent recombination (HDR). By quantifying the inhibition efficacies of LHVS in wild-type and TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficient parasites, it is shown that LHVS inhibits wild-type parasite growth more efficiently than &#916;cpl growth, suggesting that TgCPL is a target that LHVS binds to in Toxoplasma. The high sensitivity and easy operation of this luciferase-based growth assay make it suitable for monitoring Toxoplasma proliferation and evaluating drug efficacy in a high throughput manner.

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presented here is a protocol to evaluate the inhibition efficacy of chemical compounds against in vitro intracellular growth of Toxoplasma gondii using a luciferase-based growth assay. The technique is used to confirm inhibition specificity by genetic deletion of the corresponding target gene. The inhibition of LHVS against TgCPL protease is evaluated as an example.

루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포내 톡소플라즈마 곤디성장에 대한 화학적 억제제 효율 결정

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...