저자들은 다트머스 (Dartmouth)의 비교 의학 및 연구 센터 (CCMR) 직원들에게이 연구에 사용 된 마우스에 대한 전문적인 관리에 감사드립니다. Bornstein Research Fund가이 연구에 자금을 지원했습니다.

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항상성 및 질환 동안 CNS 구획 내의 세포 조성을 평가하기 위한 방법은 CNS의 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는데 필수적이다. 그러나 CNS에서 중요한 장벽 역할을 하고 다양한 면역 세포를 수용함에도 불구하고 뇌와 척수에 대한 기존의 많은 조직 추출 방법이 이러한 막의 수집을 허용하지 않기 때문에 수막은 종종 분석에서 생략됩니다. 이러한 누락은 수막의 세포 구성과 기능, 정상 상태 및 ?...

중추신경계(CNS)는 면역학적으로 특화된 부위입니다. 중추신경계 실질은 뇌척수액 공간, 수막 및 혈관계를 제외하고, 고전적으로 면역-특권 부위 1,2,3,4,5로 간주되며, 항상성 상태 동안 면역 세포가 상대적으로 없다 2,6,7. 대조적으로, 경막층, 거미층, 피아층으로 구성된 수막은 중추신경계 구획의 중요한 구성 요소로, 질병 발병기전동안 항상성 면역 감시 및 염증 과정에 적극적으로 참여합니다 3,6,7,8. 정상 상태 조건에서 수막은 선천성 림프 세포(ILC), 대식세포, 수지상 세포(DC), 비만 세포, T 세포 및 그보다 덜하지만 B 세포를 포함한 수많은 면역 감시 세포를 지원합니다 9,10,11.
수막은 고도로 혈관화된 구조이며 CNS와 그 주변 사이에 림프 연결을 제공하는 림프관을 포함합니다 8,12,13,14. CNS 손상, 감염, 자가면역 또는 신경변성에 의해 유발된 염증성 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 침투하여 수막 내의 면역 환경을 변경합니다. 세포 침윤 후, 수막은 말초 유래 면역 세포에 대한 기능적 틈새를 나타낼 수 있으며, 면역 세포 응집, 국소 면역 세포 활성화 및 CNS 구획에서의 장기 생존을 촉진할 수 있습니다. 두드러진 수막 염증은 다발성 경화증 (MS) 15,16,17,18,19, 뇌졸중 20,21, 무균 손상 22,23 (즉, 척수 손상 및 외상성 뇌 손상), 편두통 24 및 미생물 감염 25,26,27,28,29. 따라서, 수막 구획에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 특성화는 정상 상태 및 질병 발병 기전 동안 이러한 세포의 역할을 이해하는 데 필수적입니다.
두개골과 척추체에서 뇌, 척수 및 수막을 추출하는 것은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 현재 세 개의 수막층이 모두 손상되지 않은 상태에서 뇌를 빠르게 추출할 수 있는 기술은 없습니다. 추궁 절제술은 우수한 척수 조직 형태를 산출하고 수막층을 보존하지만 시간이 많이 걸리고 복잡합니다30,31. 반대로, 두개골에서 뇌를 제거하고 척수를 수압 압출하는 것과 같은 보다 전통적인 추출 방법은 CNS 조직의 빠른 추출을 용이하게 하지만 이러한 기술로 거미주막과 경막 수막이 모두 손실됩니다(30,31). 뇌 및 척수 조직의 기존 분리 동안 경막 및 지주막 층의 누락은 CNS 구획 내의 세포에 대한 불완전한 분석을 초래합니다. 따라서 수막이 손상되지 않은 CNS 조직의 빠른 추출에 초점을 맞춘 새로운 기술의 식별은 CNS 구획의 최적 분석에 매우 중요합니다.
이 원고는 생쥐에서 뇌, 척수 및 수막을 신속하게 추출하는 두 가지 방법을 제시하여 CNS 실질 및 수막에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 다운스트림 분석을 용이하게 합니다. 이러한 최적화된 프로토콜은 1) 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액 분리 및 2) 조직학적 처리를 위한 조직 준비에 중점을 둡니다. 뇌, 척수 조직, 경막 및 지주막 수막(32)으로부터 단세포 현탁액을 얻는 것은 실질 및 수막 구획 둘 다에 상주하는 세포의 동시 분석을 가능하게 한다. 단일 세포 현탁액은 시험관 내 자극 33, 효소 결합 면역스팟(ELISpot)28,34,35, 유세포 분석(36,33) 및 단일 세포 37 또는 벌크 전사체학을 수행하기 위한 세포 배양 분석을 포함한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있습니다. 또한, 두개골 또는 척추가 각각 손상되지 않은 전체 뇌 및 척수의 석회질 제거를 위해 최적화된 프로토콜은 주변 뼈의 부드러운 석회화를 허용하여 수막을 온전하게 유지하고 조직 형태를 보존합니다. 이 방법을 사용하면 실질 및 수막 공간 모두에서 면역조직화학(IHC) 또는 제자리 혼성화(ISH) 기술을 사용하여 단백질 또는 RNA를 선택적으로 식별할 수 있습니다. CNS 내에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 표현형, 활성화 상태 및 국소화의 특성화는 CNS 구획의 개별 세포 유형이 항상성 및 질병 발병기전에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 필수적인 정보를 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Aluminum foil</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37002D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-12R centrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>VWR</td><td>525-1069</td><td></td></tr><tr><td>Conical tube, 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Hauser Scientific</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-14</td><td></td></tr><tr><td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0595256</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dry ice</td><td>Airgas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #7Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>Amresco</td><td>0105-500g</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 100%</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Filter top tube, 5 mL</td><td>VWR</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Fixable viability stain 780</td><td>Becton Dickinson</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-546-146</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-586-146</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat 594</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>112-585-167</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat 650</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Andwin Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher chemical</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (anhydrous)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Airgas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mouse FC block (CD16/32)</td><td>Becton Dickinson</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HP0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (anhydrous)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher chemical</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Needle, 25 gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Normal mouse serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31881</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh strainer</td><td>VWR</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 20%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td><td>Becton Dickinson</td><td>553730</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td><td>Becton Dickinson</td><td>562329</td><td></td></tr><tr><td>Percoll density gradient media</td><td>GE healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td><td>Becton Dickinson</td><td>550994</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, 100 mm</td><td>VWR</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-636-AB150</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond Scientific Corporation</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 200 &amp;micro;l</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips, 1 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips, 200 &amp;micro;l</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1816</td><td></td></tr><tr><td>Pipette, 1 mL</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td><td>Becton Dickinson</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td><td>Abcam</td><td>ab16669</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse laminin</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse ERT-R7</td><td>Abcam</td><td>ab51824</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 1 mL</td><td>VWR</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 10 mL</td><td>VWR</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 5 mL</td><td>VWR</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-16</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors, extra fine</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter system</td><td>Millipore</td><td>20207749</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum flask</td><td>Thomas Scientific</td><td>5340-2L</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum in-line filter</td><td>Pall Corporation</td><td>4402</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum line</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06414-20</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Versa bath</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

중추신경계(CNS)는 뇌와 척수로 구성되어 있으며 말초와 중추신경계 사이의 장벽 역할을 하는 막층인 수막으로 둘러싸여 있습니다. CNS는 면역학적으로 특화된 부위이며, 정상 상태 조건에서 면역 특권은 CNS 실질에서 가장 분명합니다. 대조적으로, 수막에는 선천성 및 적응 면역 세포를 포함한 다양한 상주 세포가 있습니다. CNS 손상, 자가면역, 감염 또는 신경변성에 의해 유발되는 염증 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 들어가 수막 내에 거주할 수 있습니다. 이 세포는 CNS 질병 발병 기간 동안 유익한 작용과 해로운 작용을 모두 수행하는 것으로 생각됩니다. 이러한 지식에도 불구하고, 수막은 종종 CNS 구획을 분석할 때 간과되는데, 이는 종래의 CNS 조직 추출 방법이 수막층을 생략하기 때문이다. 이 프로토콜은 단일 세포 기술, 면역조직화학 및 현장 혼성화 방법을 통한 다운스트림 분석에 적합한 쥐 CNS 조직(즉, 뇌, 척수 및 수막)의 신속한 분리를 위한 두 가지 고유한 방법을 제시합니다. 설명된 방법은 항상성 조건 및 질병 발병 기전 동안 CNS 구획을 차지하는 세포의 표현형, 기능 및 국소화를 평가하는 데 이상적인 CNS 조직의 포괄적인 분석을 제공합니다.

이 대표적인 실험은 B 및 T 세포를 정량화하고 항상성 상태뿐만 아니라 쥐 진행성 MS 모델(즉, TMEV-IDD)에서 수막 및 실질 CNS 구획에서 B 및 T 세포 국소화를 설명하는 것을 목표로 했습니다. TMEV-IDD는 앞서 기술된 바와 같이 TMEV BeAn의 5 x 106 플라크 형성 단위 (PFU)에 의한 두개내 감염에 의해 5주령 암컷 SJL 마우스에서 유도되었다(29).
본 연구는 감염 후 120?...

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Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

isolating-central-nervous-system-tissues-associated-meninges-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.0K 조회수.  Dartmouth-Hitchcock Medical Center. 이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

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Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the immune response to an infection of the CNS, such as poliomyelitis, Lyme neuroborreliosis, or neurosyphilis, it is often necessary to isolate the CNS-infiltrating immune cells.
In this video-protocol we demonstrate how to isolate mononuclear cells (MNCs) from the CNS of a rat with EAE. The first step of this procedure requires a cardiac perfusion of the rodent with a saline solution to ensure that no blood remains in the blood vessels irrigating the CNS. Any blood contamination will artificially increase the number of apparent CNS-infiltrating MNCs and may alter the apparent composition of the immune infiltrate. We then demonstrate how to remove the brain and spinal cord of the rat for subsequent dilaceration to prepare a single-cell suspension. This suspension is separated on a two-layer Percoll gradient to isolate the MNCs. After washing, these cells are then ready to undergo any required procedure. 
Mononuclear cells isolated using this procedure are viable and can be used for electrophysiology, flow cytometry (FACS), or biochemistry. If the technique is performed under sterile conditions (using sterile instruments in a tissue culture hood) the cells can also be grown in tissue culture medium. A given cell population can be further purified using either magnetic separation procedures or a FACS.

In this video we demonstrate how to isolate mononuclear cells from the central nervous system of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis.

EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the ...

생물학

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

신경과학

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

자가면역 마우스에서 모든 CNS 상주 세포 유형을 동시에 분리

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate the still unknown etiology of MS in order to develop new treatment strategies. The myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) EAE model reproduces a self-limiting monophasic disease course with ascending paralysis within 10 days after immunization. The mice are examined daily using a clinical scoring system. MS is driven by different pathomechanisms with a specific temporal pattern, thus the investigation of the role of central nervous system (CNS)-resident cell types during disease progression is of great interest. The unique feature of this protocol is the simultaneous isolation of all principal CNS-resident cell types (microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and neurons) applicable in adult EAE and healthy mice. The dissociation of the brain and the spinal cord from adult mice is followed by magnetic-activated cell sorting (MACS) to isolate microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and neurons. Flow cytometry was used to perform quality analyses of the purified single-cell suspensions confirming viability after cell isolation and indicating the purity of each cell type of approximately 90%. In conclusion, this protocol offers a precise and comprehensive way to analyze complex cellular networks in healthy and EAE mice. Moreover, required mice numbers can be substantially reduced as all four cell types are isolated from the same mice.

저자 스포트라이트: 모든 주요 CNS 상주 세포 유형의 동시 분리를 통한 신경염증 경로 연구 

To date, protocols for the simultaneous isolation of all principal central nervous system-resident cell types from the same mouse are an unmet demand. The protocol shows a procedure applicable in na&#239;ve and experimental autoimmune encephalomyelitis mice to investigate complex cellular networks during neuroinflammation and simultaneously reduce the required mice numbers.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

Murine Brain 및 Skull Bone Marrow에서 Single-Cell Suspensions 획득

Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only in the brain, but also in the skull. A key step toward analyzing changes in immune cell populations in both the brain and skull bone marrow after brain damage (e.g., stroke) is to obtain sufficient numbers of high-quality immune cells for downstream analyses. Here, two optimized protocols are provided for isolating immune cells from the brain and skull bone marrow. The advantages of both protocols are reflected in their simplicity, speed, and efficacy in yielding a large quantity of viable immune cells. These cells may be suitable for a range of downstream applications, such as cell sorting, flow cytometry, and transcriptomic analysis. To demonstrate the effectiveness of the protocols, immunophenotyping experiments were performed on stroke brains and normal brain skull bone marrow using flow cytometry analysis, and the results aligned with findings from published studies.

저자 스포트라이트: 뇌 허혈 후 복잡한 면역 반응 조사

To investigate the immune response to brain disorders, one common approach is to analyze changes in immune cells. Here, two simple and effective protocols are provided for isolating immune cells from murine brain tissue and skull bone marrow.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only ...

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

요약

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여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리