국립 보건원에서 보조금 (R01 NS37253와 N01 NS055167)과 국립 다중 경화증 협회 (RG 3288-A6)에 의해 부분적으로 지원.

1. CFA-유화 항원을 준비 <ol><li> 이 MG / ML의 농도에서 인산염 완충 용액 (PBS)에서 기니 피그 MBP를 (Swanborg1의 방법에 따라 준비와 4 ° C에서 동결 건조된 형태로 저장) 디졸브. 합성 MBP의 펩티드 (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR가) 2를 사용하는 경우 2 밀리그램 / ML 솔루션을 준비합니다. luer-lok과 유리 주사기로 항원 용액의 적당량 (마우스 당 0.1 ML 예방 접종을해야합니다)를 작성하다. </li><li> luer-lok을 갖춘 또 다른 유리 주사기로 항원 용액과 동일 완료 Freund의 도움이되는 H37Ra (0.1WT %) (CFA, Difco 연구소)의 볼륨을 그립니다. </li><li> 세 가지 모양의 꼭지와 두 개의 유리 주사기를 연결합니다. 앞뒤 plungers을 추진하여 CFA와 MBP 솔루션을 섞는다. 유제가 형성 될때까지 움직임을 유지. </li><li> 유제가 형성되었는지 테스트하려면 하나의 주사기로 혼합물을 모두 밀어. 빈 주사기를 분리, T를 당겨그는 조금 뒤로 플런저하고 실온에서 깨끗한 물을 비커에 잔류 유제의 방울 방전. 유제 떨어지는 물의 표면에 그대로 남아있을 경우 에멀젼이 형성된다. 유제 드롭 분광 경우, 주사기를 다시 연결하고 혼합 움직임을 계속합니다. </li><li> 항원의 정확한 복용량의 전달을 보장하기 위해 예방 접종 과정 1 ML 플라스틱 주사기를 사용하십시오. 플라스틱 주사기로 항원 유제를 전송하려면, 플런저를 꺼내하고 이전 유리 주사기는 1.4으로 연결이 끊어졌습니다 세 방향 꼭지의 개통으로 빈 플라스틱 주사기를 삽입합니다. </li><li> 유리 주사기의 플런저를 밀어 가장자리에 플라스틱 주사기를 채우십시오. 다시 플라스틱 주사기의 플런저를 넣고 플라스틱 주사기에 1.2 ML 점수에 도달까지 돌려 초과 유제를 밀어. 이 책략은 공기 방울은 플라스틱 주사기 안에 갇혀되지 않도록 보장합니다. </li><li> 세 가지 모양의 꼭지에서 플라스틱 주사기를 제거합니다. 아타플라스틱 주사기로 # 26 게이지 바늘 채널. 유제 이제 바늘의 공극 볼륨을 채우고 있도록 한 ML 표시로 플런저를 민다. </li></ol> 2. 공여 마우스의 예방 접종 참고 : 여성 C57BL / 6 마우스는 일반적으로 원래 국립 보건원에서 McFarlin 조 3 설계 방법에 따라, 측면 네 개의 사이트에 항원 유제로 주입된다. 경험 조사의 경우 한 사람이 모든 작업을 수행할 수 있습니다. 초보자를위한 도움은 한 사람이 마우스를 가지고 있으며 다른 사람이 주사를하지 않도록 청한 수 있습니다. 또는, 마우스는 주사에 대한 anesthetized 될 수 있습니다. <ol><li> 목 피부로 단단히 마우스를 누른 상태 흉부와 복부에 쉽게 액세스할 수 있도록 4 번째와 5 번째 손가락 사이에 꼬리를 다시 누르고 있습니다. </li><li> (MO의 약간 오른쪽 겨드랑이 위의 흉부의 사이트에 1mL 플라스틱 주사기의 바늘을 놓으십시오사용) 및 subcutaneously 항원 유제의 0.05 ML 투입. 약간 흰 CFA의 약간 불룩한는 창백한 피부를 통해서도 볼 수있다. 약간 왼쪽 겨드랑이 위의 흉부의 사이트에 대해 동일한 단계를 반복합니다. </li><li> 꼬리를 풀어과 오른발 (마우스)으로 잡아 그것을 설정하고 4 번째와 5 번째 손가락 사이를 개최. 오른쪽 측면에서 단지 늑골 케이스 아래 사이트를 찾아 항원 유제의 0.05 ML 투입. </li><li> 오른발을 풀어, 마우스에게 다른 방법으로 돌아서 4 번째와 5 번째 손가락 사이 왼발을 (마우스) 누르고 있습니다. 왼쪽 측면에서 단지 늑골 케이스 아래 사이트를 찾아 항원 유제의 0.05 ML 투입. </li><li> 10 생쥐의 주입 후 신선한 바늘로 변경, 또는 바늘이된다 면요 dulled. </li></ol> 3. 7 ~ 10 일 예방 접종 후 조직 배양을위한 림프절 전지의 분리 <ol><li> 7-10 일 예방 접종 후 생쥐를 희생그리고 배수 림프절을 제거합니다. 안락사의 선호하는 방법은 CO 2 흡입하는 것입니다. 팔다리가 뻗어와 핀으로 보드에 고정으로 희생 후 절개 보드에 그 뒷면에 마우스를 바칩니다. 생쥐는 70 %의 에탄올을 스프레이로 침수된다. </li><li> 최대 멸균 가위와 집게와 턱까지 복부의 아래쪽 끝에서 중앙에 길이 방향 피부에 슬릿을 잘라요. </li><li> 각 다리 아래로 사타구니의 영역에서 복부 피부를 잘라. 뒤로 사타구니 림프절을 노출, 피부 파악 껍질. </li><li> 피부가 벗겨과 겨드랑이 근처의 겨드랑 림프절을 폭로 넘어뜨린 수 있도록 앞발이 (왼쪽과 오른쪽)을 따라 피부를 잘라. </li><li> 함께 일하는 포셉의 이쌍로 덮고 결합 조직을 끌어낼과 사타구니의 림프절 주위. 결합 조직이 해제되면 림프절 미만 포셉 한 쌍을 배치하고 몸에서 멀리 당기십시오. 를 삽입35mm 배양 접시에있는 임파선은 멸균 PBS로 가득. </li><li> 이쌍 포셉의를 사용하여 두 겨드랑의 림프절을 덮고있는 결합 조직을 멀리 당겨. 림프절 격리하고 배양 접시에 넣어. 출혈이 매우 어려운 림프절을 식별 만들면서 영역을 넘어 혈관을 아프게하지 않도록 매우주의하십시오. </li><li> 모든 림프절을 수집한 후, biosafety 후드에 페트리 접시를 이동합니다. 흩어져 및 기타에 대해 하나를 연삭, 포셉의 이쌍 함께 떨어져 림프절을 애타게. 또는 임파선이 배양 접시의 바닥에있는 림프절에 대해 누르면 3 ML 플라스틱 주사기의 플런저의 평평한 끝을 사용하여 헤어 졌 수 있습니다. </li><li> 세포막과 파편을 제거하는 나일론 메쉬를 통해 조롱 림프절의 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 림프절의 세포 현탁액 멸균 PBS를 사용하여 50 ML까지를 확인하십시오. 10 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기. 문화 매체에 펠렛을 Resuspend. 가능한 C를 수행엘자는 4 X 10 6 세포 / ML로 농도를 계산하고 조정합니다. UseRPMI 1,640 10 % 태아 송아지 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, 1 밀리미터 MEM 나트륨 pyruvate, 0.1 MM MEM 비 필수 아미노산, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 10 MM Hepes 버퍼와 5 X와 보충 10 -5 M 2 - 나. 세포를 resuspending 전에 미리 따뜻한 문화. </li><li> 물론 당 2 ML 볼륨 (최종 세포 농도를 8 X 10 6 세포 / 음) 24 잘 배양 접시의 문화가 세포. 100 μg / ML의 최종 농도에서 각도에 항원을 추가합니다. 5% CO 2와 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. 5 일째 세포를 품어. </li></ol> 4. 5 일 문화의 준비 시작 이후 교양 림프절 세포를 수확 <ol><li> 파스퇴르 유리 피펫이나 작은 볼륨 피펫와 함께 아래로 최대 pipetting하여 각 우물에 세포를 섞습니다. 50 ML의 원심 튜브에 세포를 수확. </li><li> 10 분 1,000 rpm으로 세포를 원심 분리기. ResusPBS의 작은 볼륨으로 세포 펠렛을 pend. </li><li> 세포를 세고 멸균 PBS와 2.5 X 10 8 셀 / ML로 실행 가능한 세포 농도를 조정합니다. # 26 게이지 바늘로 장착되어 주사기로 세포를 그립니다. </li><li> 꼬리 정맥을 치료하는 데 도움받는 생쥐의 새장 이상 가열 램프를 놓습니다. </li><li> 마우스 홀더를 사용하여, 홀더에 슬릿을 통해 마우스의 꼬리를 확장합니다. 꼬리를 확장 당기세요. 정맥을 찾습니다. </li><li> 5 X 10 7 세포를 동등해지기, 세포 현탁액의 0.2 ML / 마우스를 주사. </li></ol> 5. 받는 마우스의 Antigenic 챌린지 20 일 포스트 셀 전송 및 질병 증상의 개발 <ol><li> 도전받는 마우스 항원과 질병의 징후를 보여주는 없습니다. 절차는 &quot;기증 마우스의 예방 접종&quot;에 대한 섹션 2와 동일합니다. </li><li> 7~10일 antigenic 도전 이후 중풍 질환의 개발을 관찰. <ol><li> 질병은 꼬리에 약점으로 시작합니다. 질병은 1로 등급이있다꼬리는 이완된되면. 마우스를 한 뒷다리에 마비가되었을 때 질병은 2로 등급이있다. 질병은 모두 두 다리가 마비되면 3 등급 앞으로 크롤링할 때 마우스 모두 두 다리를 끌 수 있습니다. 마우스 마우스가 완전히 고정되어 떠나, 두 앞발의 사용을 잃게되면 질병은 4 등급된다. 마우스가 죽어가는이며 신체가 곱슬머리 때 질병은 5 등급있다. 죽음은 질병 학년 6 4로 채점된다. </li></ol></li><li> 이 프로토콜에 따라 C57BL / 6 마​​우스에서 유도된 MBP 특정 EAE는 monophasic입니다. 생쥐는 질병으로부터 회복 수도 있지만 자발 relapses을 받아야하지 않습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 받은 마우스는 대기 중이오 체외 - 확장된 기증자 림프절 세포에 질병 유도에 그들의 저항을 반영 EAE 질병 증상을 개발하지 않았다. 그러나, 심각한 질병은 antigenic 도전의 능력을 보여주는, antigenic 도전 (표 I) 후 개발저항 메커니즘을 되돌리는 인치 지적 antigenic 도전의 두 특수 기능은 항원의 접종과 질병을 유발하는 도전의 운동이 있습니다. 표 III와 같이 항원의 매우 낮은 복용량이 필요합니다. 항원 (표 IV)에 도전했을 때 놀랍게도, 올해 기증자 세포를받은 생쥐는 여전히 심각한 질병을 개발할 수 있습니다. 이 두 관측 강력히 EAE 저항을 유지하는 &quot;긴&quot;T 세포의 참여를 제안합니다. 이 프로토콜은 많은 EAE 모성 마우스 종자 4 ~ 적용됩니다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" /> 평판이 강한 마우스 종자의 EAE의 유도를위한 실험 설계의 그림 1. 플로우 차트. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> 임상 EAE 입양 전송 후 </td><td colspan="3"><stroNG&gt; 임상 EAE antigenic 도전 후 </td></tr><tr><td> 변형 </td><td> 항원 </td><td> 투사 </td><td> AV. 질병 학년 (범위) </td><td> AV. 발병의 일 (범위) </td><td> 투사 </td><td> AV. 질병 학년 (범위) </td><td> AV. 발병의 일 (범위) </td></tr><tr><td> SJL </td><td> MBP </td><td> 21분의 21 </td><td> 4.0 (3-5) </td><td> 8.0 (6-10) </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP </td><td> 0 / 10 </td><td> - </td><td> - </td><td> 7분의 7 </td><td> 3.85 (3-5) </td><td> 9.28 (9-10) </td></tr><tr><td> Balb / C </td><td> MBP </td><td> 0 / 7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 5분의 5 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 7.0 (7) </td></tr><tr><td> C3H/HeJ </td&gt; <td> MBP </td><td> 0 / 7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 8.0 (8) </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP 60-80 </td><td> 0 / 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4분의 4 </td><td> 2.75 (2-4) </td><td> 10.2 (9-11) </td></tr></tbody></table> 표 나. MBP-매개 C57BL에서 EAE / 6 생쥐의 유도. C57Bl / 6 생쥐에서 대기 중이오 체외 - 확장된 공여 세포로 유도 않았 EAE의 입양 전송됩니다. Antigenic의 도전 포스트 셀 전송 질병 유도에 감염될 쥐를 렌더링. AV., 평균. ND는 끝나지 않았어. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> antigenic 도전 후에 임상 EAE </td></tr><tr><td> 마중물 항원 </td><td> 도전 항원 </td><td> 투사 </td><td> AV. 질병 학년 (범위)</td><td> AV. 발병의 일 (범위) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> CFA 혼자 </td><td> 0 / 3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> OVA-CFA </td><td> 0 / 3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> MBP-CFA </td><td> 3분의 3 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 7.7 (7-9) </td></tr></tbody></table> antigenic의 도전 표 II. 특이성. 받는 생쥐 마중물 항원뿐만 아니라 다른 관련없는 항원에 도전했다. 오직 마중물 항원은 심각한 질병을 유도. OVA : 닭고기 ovalbumin. AV., 평균. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td></td><td colspan="3"> antigenic 도전 후에 임상 EAE </td></tr><tr><td> 도전 항원 접종 (μg / 마우스) </td><td> 투사 </td><td> AV. 질병 학년 (범위) </td><td> AV. 발병의 일 (범위) </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.67 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.25 (3-4) </td><td> 8.25 (7-10) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (8-9) </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.76 (8-9) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4분의 4 </td><td> 2.5 (2-3) </td><td> 9.75 (9-10) </td></tr><tr><td> 일 </td><td> 4분의 2 </td><td> 1.0 (1.0) </td><td&gt; 16 (14-18) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0 / 4 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 III. 도전 항원 접종은 질병 유도를 위해 필요합니다. 받는 생쥐에 도전하는 데 사용 MBP의 다양한 농도가 테스트되었습니다. AV., 평균. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> antigenic 도전 후에 임상 EAE </td></tr><tr><td> 도전 항원 </td><td> 도전의 날 </td><td> 투사 </td><td> AV. 질병 학년 (범위) </td><td> AV. 발병의 날 (범위) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 5 </td><td> 4분의 3 </td><td> 1.33 (1-2) </td><td> 9.67 (9-10) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 10 </TD&gt; <td> 4분의 4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 15 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 7.25 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 25 </td><td> 4분의 4 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 8.0 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 35 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.5 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 60 </td><td> 4분의 4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 9.0 (8-10) </td></tr><tr><td colspan="5"> -------------------------- </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 343 </td><td> 3분의 3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 10.33 (10-11) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 445 </td><td> 3분의 3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 7.0 (7.0) </td></tr></tbody></table> antigenic 도전의 표 IV. 속도론. 받는 생쥐 채택 다양한 시점 포스트에 도전했다필자 셀 부가됩니다. AV., 평균.

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	<li>Swanborg, R. H., Sabato, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis.">Experimental allergic encephalomyelitis.</a> Methods in Enzymology. 162, 413-421 (1988).</li><li>Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myelin+basic+protein-specific+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice:+Mapping+of+T+cell+epitopes+and+T+cell+Vb+gene+segment+usage.">Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage.</a> J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).</li><li>McCarron, R., McFarlin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+SJL/J,+PL/J,+and+(SJL/J+x+PL/J)F1+mice.+Influence+of+I-A+haplotypes+on+encephalitogenic+epitope+of+myelin+basic+protein.">Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein.</a> J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).</li><li>Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -. L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge+induces+consistent+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+and+other+reputed+resistant+strains.">A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains.</a> J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).</li><li>Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+and+T-effector+cells+in+autoimmune+CNS+inflammation:+a+delicate+balance+easily+disturbed.">Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed.</a> Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).</li><li>Arnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+-+susceptibility+and+suppression.">Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression.</a> Immunol. Rev. 55, 5 (1981).</li><li>Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+mice+by+antibodies+against+IFN-g.">Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g.</a> J. 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아니 재정 공시.

생쥐에서 EAE의 연구는 종종 neuroantigens, myelin 기본 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP) 또는 myelin oligodendrocyte 단백질 (소)를 사용합니다. 이전 연구는 주로 MBP를 사용했습니다. PLP는 SJL 생쥐에서 강력하고 일관된 반응을 자극. B6 생쥐가이 항원과 질병 유도에 감염될 때문에 최근에는 집고 양이가 사용되는 일반적인 neuroantigen입니다. 유전자 타겟 마우스 종자의 대부분은 B6 유전 배경에 있습니다. 흥미...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 기니 돼지 척수 코드 </td><td> 록클랜드 Immuno - 화학 주식 회사 Gilbertsville, PA 19525 <a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank">www.rockland-inc.com</a> </td><td> GP-T065 </td><td> 냉동 </td></tr><tr><td> Freund의 도움이되는 완벽한 H37Ra </td><td> Difco Laboratories의 디트로이트, MI </td><td> 231,131 </td><td></td></tr><tr><td> Multifit 교환 가능한 주사기 </td><td> BD <a href="http://www.bd.com/us" target="_blank">www.bd.com / 우리</a> </td><td> 512,133 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech주식 회사 매나 사스, VA <a href="http://www.cellgro.com" target="_blank">www.cellgro.com</a> </td><td> 10-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> OVA </td><td> 시그마 - 올드 리치 <a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a> </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 바 하버, 메인 </td><td> B6 생쥐 : 0,000,664 </td><td></td></tr></tbody></table>

overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge

실험적 면역 encephalomyelitis (EAE)은 중추 신경계 (CNS)의 염증성 질환이며, 인간의 demyelinating 질환, 다중 경화증 (MS)의 연구를위한 동물 모델로 사용되었습니다. EAE는 CNS에 mononuclear 세포의 pathologic 침투 의해 중풍 질병의 임상 발현이 특징입니다. 다른 강한 반면 MS와 마찬가지로, EAE 그 특정 마우스 종자에 유전자 통제 또한 질병 유도에 감염될 수 있습니다. 일반적으로, C57BL / 6 (H-2 b)는 쥐가 myelin 기본 단백질과 예방 접종 (MBP) 중풍 징후를 개발하기 위해 실패합니다. 여기에 설명된 실험 프로토콜이 C57BL / 6 마​​우스뿐만 아니라 다른 유명한 모성 마우스 종자에 심각한 EAE를 유도하는 데 사용되었던대로이 응답하지 않는 문제는 확실히 항원 처리 또는 MBP의 항원 프레 젠 테이션의 결함으로 인해하지 않습니다. 또한, C57BL / 6와 MBP에 대한 반응 Balb / C 마우스에서 encephalitogenic T 세포 클론은 성공이었다완전히 격리 및 전파. 실험 프로토콜 (200 μg / 마우스) MBP-중이오 C57BL / 6 기증자 림프절 세포가 격리되고 MBP-특정 T 세포의 수영장을 확장하기 위해 항원과 함께 5 일 동안 배양해있는 셀룰러 입양 전송 시스템을 사용하는 것입니다. 문화 시대 말기에 50,000,000 가능한 전지는 꼬리 정맥을 통해 순진 syngeneic 수신자로 전송됩니다. 그래서 일반적으로 치료받는 생쥐 따라서 그들의 저항 상태를 재확인, EAE를 개발하지 않으며, 그들은 무한정 정상 남아있을 수 있습니다. 열흘 포스트 셀 전송은받는 생쥐 전체 Freund 도움이되는 (CFA) - 유화 측면 네 개의 사이트에 MBP 맡고있다. 심한 EAE는 10-14일 도전 후이 생쥐로 개발하기 시작합니다. 결과는 관련이없는 항원과 도전이 질병의 임상 증상을 유발하지 않았다으로 질병의 유도는 antigenic의 구체적인 것을 보여주었다. 중요한 것은 항원 선량의 적정가로 사용되는도전받는 생쥐는 5 μg / 마우스처럼 낮은 될 수 있다고했다. 또한, antigenic의 도전의 타이밍의 운동 연구 질병을 유발하는 도전 5 일 게시물 antigenic 도전 및 445 일 포스트 antigenic 도전여 그 와중에 이르면 효과였다 보여주었다. 응답하지 않는 문제를 유지 &quot;긴&quot;T 세포 인구의 참여 향한 이러한 데이터는 강력하게 가리 킵니다. 이 시스템의 규제 T 세포 (Tregs)의 참여가 정의되지 않았습니다.

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Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

20.2K 조회수.  St. John-Providence Health System. 특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

비디오: Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

연구

면역학 및 감염병학

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While the exact etiology of the disease is yet unclear, autoreactive T lymphocytes are thought to play a central role in its pathophysiology. MS therapy is only partially effective so far and research efforts continue to expand our knowledge on the pathophysiology of the disease and to develop novel treatment strategies. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model for MS sharing many clinical and pathophysiological features. There is a broad diversity of EAE models which reflect different clinical, immunological and histological aspects of human MS. Actively-induced EAE in mice is the easiest inducible model with robust and replicable results. It is especially suited for investigating the effects of drugs or of particular genes by using transgenic mice challenged by autoimmune neuroinflammation. Therefore, mice are immunized with CNS homogenates or peptides of myelin proteins. Due to the low immunogenic potential of these peptides, strong adjuvants are used. EAE susceptibility and phenotype depends on the chosen antigen and rodent strain. C57BL/6 mice are the commonly used strain for transgenic mouse construction and respond among others to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The immunogenic epitope MOG35-55 is suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) prior to immunization and pertussis toxin is applied on the day of immunization and two days later. Mice develop a "classic" self-limited monophasic EAE with ascending flaccid paralysis within 9-14 days after immunization. Mice are evaluated daily using a clinical scoring system for 25-50 days. Special considerations for care taking of animals with EAE as well as potential applications and limitations of this model are discussed.

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an established animal model of multiple sclerosis. C57BL/6 mice are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG35-55), resulting in an ascending flaccid paralysis caused by autoreactive immune cells in the central nervous system. Protocols for disease induction and monitoring will be discussed.

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 유도

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

포도당-6-인산염 이사머라제(G6PI)-유도 RA 마우스에서 iNKT 세포의 입양 면역 요법

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular inflammatory disease model recapitulate the clinical phenotype of posterior uveitis affecting humans. EAU has been used reliably to study the efficacy of novel inflammatory therapeutics, their mode of action and to further investigate the mechanisms that underpin disease progression of intraocular disorders. Here, we provide a detailed protocol on EAU induction in the C57BL/6J mouse - the most widely used model organism with susceptibility to this disease. Clinical assessment of disease severity and progression will be demonstrated using fundoscopy, histological examination and fluorescein angiography. The induction procedure involves subcutaneous&#160;injection of an emulsion containing a peptide (IRBP1-20) from the ocular protein interphotoreceptor retinoid binding protein (also known as retinol binding protein 3), Complete Freund&#39;s Adjuvant (CFA) and supplemented with killed Mycobacterium tuberculosis. Injection of this viscous emulsion on the back of the neck is followed by a single intraperitoneal injection of Bordetella pertussis toxin. At the onset of symptoms (day 12-14) and under general anesthesia, fundoscopic images are taken to assess disease progression through clinical examination. These data can be directly compared with those at later timepoints and peak disease (day 20-22) with differences analyzed. At the same time, this protocol allows the investigator to assess potential differences in vessel permeability and damage using fluorescein angiography. EAU can be induced in other mouse strains - both wildtype or genetically modified - and combined with novel therapies offering flexibility for studying drug efficacy and/or disease mechanisms.

In this report we present a protocol that allows the investigator to generate a mouse model of intraocular uveitis. More commonly referred to as experimental autoimmune uveitis (EAU), this established model captures many aspects of human disease. Herein, we will describe how to induce and monitor disease progression using several readouts.

실험적 자가면역 포도막염: 안구내 염증성 마우스 모델

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

자가면역뇌척수염에서 Mycobacterium paratuberculosis에 의한 면역원성 향상

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) containing inactivated Mycobacterium tuberculosis. The antigenic components of the mycobacterium activate dendritic cells to stimulate T-cells to produce cytokines that promote the Th1 response via toll-like receptors. Therefore, the amount and species of mycobacteria present during the antigenic challenge are directly related to the development of EAE. This methods paper presents an alternative protocol to induce EAE in C57BL/6 mice using a modified incomplete Freund&#39;s adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strain K-10.
M. paratuberculosis, a member of the Mycobacterium avium complex, is the causative agent of Johne&#39;s disease in ruminants and has been identified as a risk factor for several human T-cell-mediated disorders, including multiple sclerosis. Overall, mice immunized with Mycobacterium paratuberculosis showed earlier onset and greater disease severity than mice immunized with CFA containing the strain of M. tuberculosis H37Ra at the same doses of 4 mg/mL. The antigenic determinants of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP)&#160;strain K-10 were able to induce a strong Th1 cellular response during the effector phase, characterized by significantly higher numbers of T-lymphocytes (CD4+ CD27+), dendritic cells (CD11c+ I-A/I-E+), and monocytes (CD11b+ CD115+) in the spleen compared to mice immunized with CFA. Furthermore, the proliferative T-cell response to the MOG peptide appeared to be highest in M. paratuberculosis-immunized mice. The use of an encephalitogen (e.g., MOG35-55) emulsified in an adjuvant containing M. paratuberculosis in the formulation may be an alternative and validated method to activate dendritic cells for priming myelin epitope-specific CD4+ T-cells during the induction phase of EAE.

저자 스포트라이트: 실험적 자가면역 뇌척수염 중 자가항원의 면역원성 향상에 대한 Mycobacterium paratuberculosis의 보조 활성  

Here, we present an alternative protocol to actively induce experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, using the immunogenic epitope myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspended in incomplete Freund's adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...