이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (R37CA228304 및 R01HL146642 Xi 첸, CA148761 제프리 M. 로젠), 미국 국방부 (W81XWH-19-1-0524 → Xi Chen), W81XWH-19-1-0035 ~ 샹동 Lv), 미국 암 학회(RSG-18-181-01-TBE to Xi Chen), 텍사스 암 예방 및 연구 연구소(RR150009 CPRIT) 베일러 의과 대학의 환자 파생 제노이식 및 고급 생체 모델 코어 (RP170691 CPRIT 코어 시설 상 및 NCI-CA125123 P30 암 센터 지원 보조금의 자금 지원).

동물을 사용하는 모든 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 종양 파편, 약 1-2 mm3 크기, 베일러 의과 대학에서 환자 파생 된 제노 이식 및 고급 생체 모델 코어에서 얻은 유리냉동 주식에서.
1. 이식을 위한 극저온 보존 유방 종양 단편의 준비
<ol><li>액체 질소에서 37°C 수조로 종양 단편으로 극저온을 전달합니다.</li>
	<li>해동 하는 동안 가끔 부드러운 영화와 극저온을 자극.</li>
	<li>조직이 해동 된 후, 수조에서 극저온을 꺼내 부드러운 반전으로 섞습니다.</li>
	<li>극저온의 바깥쪽을 건조하고 70%에탄올로 스프레이하세요. 생물 안전 후드로 옮기.</li>
	<li>해동된 종양 조직을 15mL 원추형 튜브로 옮기고 10mL의 콜드 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)로 채우한다. 튜브를 반전시켜 잘 섞어보십시오. 조직 파편이 튜브 의 바닥에 정착하도록 허용합니다.</li>
	<li>초퍼를 흡인하고 차가운 DMEM의 10 mL에서 재중단. 튜브를 반전시켜 잘 섞어보십시오. 조직 파편이 튜브 의 바닥에 정착하도록 허용합니다.</li>
	<li>초퍼를 흡인하고 차가운 DMEM의 10 mL에서 재중단. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 참고 : 조직은 이식 할 준비가되어 있습니다.</li>
</ol>2. 이식을 위한 신선한 유방 종양의 수집 및 준비
<ol><li>유방 종양 베어링 마우스를 안락사시하십시오. 참고: PDX 숙주 SCID/베이지, NSG 또는 NRG 여성 마우스는 현재 연구에서 3-5주 동안 여성 Balb/c 마우스가 사용될 수 있다.</li>
	<li>안락사 마우스의 종양 부위를 70%에탄올로 분사한다. 참고: 극저온 저장 또는 이식을 위한 종양 단편의 오염을 일으키는 원인이 될 수 있는 종양 견본을 가진 머리를 피하십시오.</li>
	<li>종양을 둘러싼 피부를 꼬집고 들어 올리기 위해 톱니 모양의 집게를 사용하여 가위를 사용하여 절개를 짧게 만듭니다.</li>
	<li>종양을 가위로 피부에서 분리하여 전체 종양을 숙주 마우스로부터 해부합니다. 종양의 외부 표면에서 남은 마우스 지방 패드 조직을 잘라냅니다. 감기 DMEM의 5 mL로 채워진 15 mL 원추형 관에 종양을 놓습니다. 참고: 더 큰 종양은 괴사 코어를 포함할 가능성이 있기 때문에 최대 1cm 직경의 종양을 사용하십시오.</li>
	<li>생물 안전 후드에서 해부된 종양을 건조를 방지하기에 충분한 DMEM을 함유한 멸균 10cm 페트리 접시로 옮기.</li>
	<li>무균 조건하에서 메스 또는 블레이드로 종양을 1mm3 조각으로 자른다. 참고: 메스 또는 블레이드는 사용하기 전에 최소 20분 동안 생물 안전 후드의 UV 아래에 노출되어야 합니다.</li>
	<li>종양 단편을 감기 DMEM으로 채워진 15 mL 원추형 튜브로 이송합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 참고 : 조직은 이식 할 준비가되어 있습니다. 단계 2.4에서 해부된 종양 단편은, 1) 단백질 및 RNA/DNA 추출을 위한 액체 질소에서 냉동스냅, 2) 헤마톡시린과 에신(H&E) 및 면역히스토케미칼(IHC) 분석 또는 3)에 대한 4% 파라포름데히드(PFA) 또는 10% 중성 완충포포체(NBF)로 고정된 1.25mL 동결 매체(10% 디메실알)에서 냉동 40% DMEM 및 50% 태아 소 혈청 [FBS]) -80°C 냉동고에서 하룻밤 동안 천천히 동결한 다음 장기 저장을 위해 액체 질소로 이송한다.</li>
</ol>3. 수술을 위해 동물을 준비
<ol><li>동물 통증 관리를 위해, 피하 부프레노르핀 지속 방출을 피하 60 분 전에 1 mg /kg의 용량으로 또는 진통제 커버리지의 72 h에 대한 기관의 가이드를 따르십시오.</li>
	<li>무균 수술에 대한 제도적 지침에 따라 수술 스위트 를 설정합니다.</li>
	<li>이소플루란 마취기계의 유도챔버에서 4주된 암컷을 ~11.25mL/h의 속도로 마취한다. 마우스를 절차 영역으로 옮기고, 멸균(실리콘 고무) 수술 보드에 전달하여 작은 안면 마스크를 통해 마취를 받게 됩니다. 마우스를 등에 대고 다리를 자연스러운 자세로 테이프로 놓습니다. 참고: SCID/베이지, NSG 또는 NRG는 PDX에 사용되며 Balb/c는 GEMM 이식 모델에 사용됩니다.</li>
	<li>안과 연고를 눈에 바르면 건조를 방지하십시오.</li>
	<li>발가락 핀치에 의해 적절한 수준의 감착을 확인합니다. 참고: 동물의 반응/움직임은 동물이 충분히 마취되고 수술을 받을 준비가 되어 있음을 나타냅니다.</li>
	<li>하복부, 특히 수술이 일어나는 네 번째 젖꼭지 주위 의 부위에 마우스를 면도하십시오.</li>
	<li>원형 운동을 사용하여 수술 부위의 중심에서 시작하여 포비도네 요오드 수술 스크럽으로 바깥 쪽 가장자리를 향해 작업한 다음 70 %의 이소 프로필 에탄올 패드로 포비도네 요오드를 제거하십시오. 두 번 더 반복합니다.</li>
</ol>4. 종양 단편을 네 번째 (잉구이날) 유방 지방 패드로 이식
<ol><li>절개 부위를 제외한 동물의 몸을 덮기 위해 멸균 수술 커튼을 사용하십시오. 참고: 절개를 하기 전에 발가락 핀치에 의한 적절한 수준의 침전수준을 확인합니다.</li>
	<li>톱니 모양의 집게를 사용하여 #4 젖꼭지에서 피부를 들어 올립니다.</li>
	<li>무딘 면을 아래로, 머리쪽으로 #4 젖꼭지에서 짧은 (약 1cm), 기생 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다.</li>
	<li>면 기울어진 어플리케이터를 사용하여 절개 측의 복막과 피부를 분리합니다.</li>
	<li>절개 의 측면측면을 잡고있는 동안, 부드럽게 같은 면봉을 사용하여 피부에서 #4 매머 지방 패드를 벗깁니다.</li>
	<li>지방 패드가 분리되면 동물의 몸에 27 G 바늘로 피부를 고정하십시오.</li>
	<li>내인성 마우스 유방 상피의 지방 패드를 지울 필요가 있는 경우 다음 단계를 수행한다.<ol>
<li>톱니모양 의 집게를 사용하여 지방 패드를 몸에서 부드럽게 확장하고 동맥의 주요 혈관의 교차점 아래에 있는 잉구인 림프절을 찾습니다(집게가 동맥을 들고 있는 곳 가까이).</li>
		<li>조심스럽게 림프절과 삼각형 영역을 형성하는 네 번째와 다섯 번째 지방 패드에 합류 지방에 혈관을 소작. 참고: 이 단계의 산소 공급원을 일시적으로 끕니다.</li>
		<li>마이크로 해부 가위를 사용하여 각 소작 혈관을 한 번에 하나씩 잘라냅니다 (각 절단 후 출혈이 없도록) 림프절을 포함하는 지방 패드의 섹션이 제거 될 때까지.</li>
		<li>"지워진" 지방 패드 조직을 폐기하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>무딘 분리 집게를 사용하여 네 번째 유방 지방 패드를 잡습니다. 다른 한편으로, 각진 미세 포셉의 닫힌 끝을 나머지 용기 위에 있는 지방 패드의 중앙에 삽입하고 복막 벽에 가깝게 삽입한다. 집게를 천천히 열어 작은 주머니를 만듭니다. 지방 패드에서 각진 미세 한 집게를 제거합니다.</li>
	<li>각진 미세 한 집게를 사용 하 여, 종양 조각의 조각을 가지고 주머니에 삽입.</li>
	<li>천천히 집게 팁을 열어 종양 조각을 지방 패드 포켓으로 방출합니다.</li>
	<li>각진 미세 한 집게를 조심스럽게 철회하십시오. 참고: 주머니를 보면, 집게를 인출할 때 종양 조각이 유방 지방 패드의 주머니에 남아 있음을 확인합니다. 종양은 과잉 종양 조직이 실험 또는 은행에 필요할 때 두 가지 반대 지방 패드로 이식 될 수 있습니다. 양면 이식을 가진 동물은 반대로 종양 사이 알려진 상호 작용 때문에 처리 연구 결과를 위해 추천되지 않습니다. 또는, 트로카 장치는 이식 과정에 사용될 수 있다.</li>
	<li>절개 기저에서 시작하여 발톱과 톱니 모양의 집게를 사용하여 양쪽의 피부를 수집합니다. 양면을 함께 가져와 서서감 클립 적용을 위해 피부를 준비합니다. 절개 가장자리를 발톱 집게로 말리고 가장자리를 함께 꼬집어 상단의 연속 표면을 형성합니다.</li>
	<li>톱니 모양의 집게와 함께 양면을 잡고 상처 클립 어플리케이터를 사용하여 절개 중앙에 상처 클립을 배치합니다. 필요한 경우, 조직을 닫고 고정시키기 위해 절개 끝에 조직 접착제를 적용하십시오.</li>
	<li>동물을 온난한 표면에 있는 깨끗한 케이지에 넣습니다. 출혈, 퇴적의 징후 및 수술 후 기간 동안 통증을 모니터링하십시오. 동물은 수술 후 몇 분 이내에 위로 이동하고 있어야합니다.</li>
	<li>수술 후 최소 3일 동안 동물의 절개 부위와 전반적인 건강에 주의를 기울이는 다. 통증 관리를 위한 제도적 지침을 따르십시오.</li>
	<li>다음 이식을 계속하기 전에 유리 구슬 소독기에 10 s의 수술 도구를 청소하십시오. 사용하기 전에 도구가 식을 때까지 기다립니다.</li>
	<li>모든 마우스가 이식될 때까지 4.1-4.15 단계를 반복합니다. 참고: 에스트로겐 보충은 ER+ 종양에 필요하며, 이는 물 또는 느린 방출펠릿(59)을통해 공급될 수 있다.</li>
</ol>5. 약물 치료에 대한 반응으로 종양 성장 모니터링
참고: 확립된 이식 가능한 PDX와 p53-null 종양의 만져볼 수 있는 종양은 본질적인 종양 성장 속도에 따라 수술 후 개발하는 데 2주에서 8주 사이가 걸립니다.
<ol><li>일주일에 두 번 캘리퍼를 사용하여 2 차원으로 종양을 측정합니다. 수식을 사용하여 볼륨을 계산합니다. 종양 부피 (mm3)= W2 x L /2 여기서 W는 폭이고 L은 종양의 길이입니다.</li>
	<li>종양 부피가 150-300mm3에도달하면 약물 치료를 시작합니다. 참고: 약물의 특성에 따라 경구 관증 또는 복막 주사가 약물을 전달하는 데 사용될 수 있다.</li>
	<li>종양 샘플을 수집하고 다양한 목적을 위해 IHC 염색60,단백질 및 RNA/DNA 격리 및 면역 페노티핑61을 수행한다. 혈액을 수집하고 면역 phenotyping을 수행하거나 약동 / 약학 연구에 사용합니다.</li>
</ol>

MTL은 StemMed, Ltd.의 제한된 파트너의 창립자이자 일반 파트너인 StemMed Holdings의 설립자이자 매니저입니다. MTL은 트카르디 테라피의 창립자이자 주식 보유자이며, 주식회사 LED는 StemMed, Ltd.의 보상 직원입니다.

동물에 걸쳐 종양 성장의 변이를 줄이기 위해, 이식을 위한 1 mm3 단편으로 종양 조직을 절단하는 것이 중요합니다. 연조직을 성장하는 모델은 작업하기가 어렵고 종양 단편은 약간 더 커야합니다 (1-2 mm3). 매머 지방 패드 포켓에 조직을 배치 할 때이 여러 작은 종양 이나 이상한 모양의 종양귀착될 것이기 때문에 여러 조각으로 조직을 분할하지 않도록주의하십시오.
<p class="jove_c...

대부분의 유방암 사망은 종래의 치료법1,2에내성이 있는 재발성 질환으로 간주될 수 있다. 유방암의 종양 간 및 종양 이질성은 치료 저항에 기여합니다. 더욱이, 종양 이질성은 정확한 예후에 영향을 미칠 수 있고 질병 관리에도전할수 있다3,4. 반응의 예측 바이오마커의 식별은 유방암 환자의 임상 결과를 크게 향상시킬 것입니다. 대부분의 유방암 유형은 면역 요법에 반응하지 않을 가능성이 있는 면역학적으로 '감기' 종양이지만 면역 체크포인트 억제제는 임상 시험2,5에서약속을 보여주었습니다. 예를 들어, 단계 III 예심은 질병없는 생존 (DFS) 및 nab-paclitaxel과 결합된 아테졸리주맙 (PD-L1에 대한 단일 클론 항체)이 ≥1% PD-L1 염색6을가진 종양에서 혼자 nab-paclitaxel와 비교하여 전반적인 생존 혜택을 제공할 수 있다는 예비 증거를 보여주었다. 면역 요법에 유방 종양을 민감하게 하는 치료법의 개발은 치료 요법에 혁명을 일으킬 것입니다.
인간 유방암 이질성 및 약물 반응을 충실하게 재구성하는 전임상 모델은 종양 생물학을 연구하고 표적 치료를 위한 잠재적인 바이오마커를 식별하는 데 매우 중요합니다. 불멸의 세포주는 이러한 세포주 성장하기 쉽고 분자 메커니즘을 연구하기 위해 유전적으로 수정하기 쉽기 때문에 유방암 연구에 널리 사용됩니다. 그러나, 시험관내 장기 세포 배양으로부터의 선택적 압력으로 인해, 유전적 드리프트는 시간이 지남에 따라 발생할 수 있으며 유방암 세포주는 1차 유방종양의수차와 구별되는 세포주별 게놈 변화를 월아닐 수 있다7,8,9.
환자 유래 이종이식(PDX) 종양 청크는 인간 질환의 이질성을 회수할 수 있으며, 조직학적및 면역학적으로기원10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 20,21, 22 ,23,24,25,26,27,28, 29. 중요하게도, PDX 모델은 연공서학, 전사, 프로테아메 및 게놈분석10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22에 의해 입증된 바와 같이 여러 이식에 걸쳐 전형적으로 안정되어있습니다. ,23,24,25,26,27,28, 29. PDX 모델은 임상적으로 관찰된 것과 비교하여 치료 반응을 나타내며,10,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. 에스트로겐 수용체 양성(ER+),프로게스테론 수용체 양성(PR+),표피 성장 인자 2 양성(ERBB2+,HER2+)및 삼중 음성 유방암(TNBC) PDX 모델을 위한 PDX 모델이 확립되었으며, 내분비, 화학요법 및 표적 요법을 테스트할 수 있는 우수한 플랫폼을 제공한다. 그러나, 현재 PDX 모델의 한 가지 주요 주의 사항은 마우스에 기능성 면역 계통의 부족이다.
Trp53 homozygous null, cMyc, Wnt1, PyMT, 또는 Her2 과발현 모델과 같은 유전자 조작 마우스 모델 (GEMM)은 그대로 면역 계통의 맥락에서 자발적인 종양 개시, 진행 및 전이에 대한 연구를 허용합니다. 그러나, 종양 대기 시간이 길어지므로여러 팔(30,31)으로전임상 시험을 수행하기가 어렵다. 그러나 GEMM은 합성 숙주에게 이식하여 인간 종양32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 44, 45,45, 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55. 예를 들어, p53-null BALB/c 마우스로부터의 유방 상피는 1차 종양을 형성하기 위해 신디사이진 야생형 수신자 마우스의 클리어지방 패드로 이식되어56,57로추가이식될 수 있다. p53-null 종양은 인간 종양의 다른 특수형을 재구성했습니다.
PDX 모델과 이식 가능한 GEMM의 조합은 유방 종양 생물학, 약물 반응 및 항 종양 면역을 조사하기 위한 귀중한 전임상 도구를 제공합니다. 현재 프로토콜에서, PDX 및 GEMM 종양 단편의 정형소 이식 방법이 마우스 유방 지방 패드로 설명된다. 이러한 모델은 직렬 통로에 적합하며 일반적으로 안정적인 표현형을 유지합니다. 시간이 지남에 따라 항로에 걸쳐 유전 적 드리프트 또는 이질성의 손실의 위험을 완화하기 위해, 여러 조직 단편은 시간이 지남에 따라 생물학적 또는 형태학적 변화가 관찰되는 경우에 후속 이식을 위한 각 통로에서 냉동 보존된다29,58.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

종양 이질성 및 치료 반응을 충실하게 재구성하는 전임상 모델은 번역형 유방암 연구에 매우 중요합니다. 불멸의 세포주성장은 쉽게 성장하고 유전적으로 분자 메커니즘을 연구하기 위하여 수정합니다, 그러나 세포 배양에서 선택적인 압력은 수시로 시간이 지남에 유전과 후성적인 변경으로 이끌어 냅니다. 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 인간 유방 종양의 이질성 및 약물 반응을 충실하게 재구성합니다. PDX 모델은 유방 종양 생물학 및 약물 반응의 조사를 용이하게 하는 직교 이식 후에 상대적으로 짧은 대기 시간을 전시합니다. 이식 가능한 유전자 조작 마우스 모델은 유방 종양 면역의 연구를 허용합니다. 현재 프로토콜은 유방 지방 패드로 유방 종양 단편을 정형 전적으로 이식하는 방법을 설명하고 약물 치료에 이어. 이 전임상 모형은 유방 종양 생물학, 약 반응, biomarker 발견 및 약 저항의 기계장치를 조사하기 위하여 귀중한 접근을 제공합니다.

도 1은 직교 이식의장비(도 1A)및 주요 절차(도1B)를나타낸다. 도 2는 이식된 PDX 종양(MC1)의 특성화를 나타낸다. MC1 모델의 종양 단편(1mm3)은SCID/베이지 마우스의 #4 지방 패드로 이식되었다. 한 달 후, 평균 종양 크기는 약 350mm3에도달했다. 종양 ...

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

환자 유래 제노이식(PDX) 모델과 이식 가능한 유전자 조작 마우스 모델은 인체 질환을 충실히 재구성하고 기본 및 번역 형 유방암 연구를 위한 선호 모델입니다. 여기서, 종양 생물학을 연구하고 약물 반응을 평가하기 위해 유방 지방 패드로 유방 종양 단편을 정형전으로 이식하는 방법이 설명된다.

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.8K 조회수.  Baylor College of Medicine. 환자 유래 제노이식(PDX) 모델과 이식 가능한 유전자 조작 마우스 모델은 인체 질환을 충실히 재구성하고 기본 및 번역 형 유방암 연구를 위한 선호 모델입니다. 여기서, 종양 생물학을 연구하고 약물 반응을 평가하기 위해 유방 지방 패드로 유방 종양 단편을 정형전으로 이식하는 방법이 설명된다.

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

유방암 관련 림프 부종의 초음파 평가

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

유방암 센티넬 노드 생검에 있는 단 하나 기술로 1% 메틸렌 청색염의 응용

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...