우리는 빈 강 SCP2 셀 라인을 제공 하기 위한 및 편집에 크리스티 아 베르나를 감사 하 고 싶습니다.

인간 osteoclasts 준 서 면된 동의 연구에 참여 하는 건강 한 기증자의 PBMCs에서 분화 되었다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
 1. osteoclast 차별화 참고: EDTA에 건강 한 인간 기증자 로부터 말 초 혈액 이나 버 피 코트를 수집. 말 초 혈액의 미만 20 mL를 사용 하지 마십시오. 버 피 코트는 들은 단 세포의 더 큰 풍부 때문에 바람직합니다. 메 마른 조직 문화 후드에 모든 다음 단계를 수행.
<li>희석 EDTA 전 혈 1:1 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x <ol>. 다시 잘 중단.</li>
	<li>레이어 림프 구 분리 미디어 (PBS 혈액: 림프 구 분리 미디어, 2:1) 50 mL 튜브에.
	<ol><li>혈액 50 mL 튜브에 PBS에 희석의 30 mL를 플라스틱.</li>
		<li>부드럽게 림프 구 분리 미디어의 15 mL 50 mL 튜브의 하단에 아래에 배치.</li>
	</ol></li> <li>실내 온도 (브레이크)에 10 분 동안 757 × g에서 원심 분리기.</li>
	<li>단 세포를 수집: <ol><li>agitating 없이 단 셀 5 mL 피 펫의 흰색 레이어를 수집 하 고 새로운 50 mL 튜브에.</li>
		<li>PBS의 20 mL와 함께 수집된 PBMCs 희석.</li>
	</ol></li> <li>는 PBMCs 세척: <ol><li>실 온에서 5 분에 대 한 225 x g에서 원심 분리기.</li>
		<li>튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다. 한번 반복.</li>
	</ol></li> <li>RBC 세포: 참고: 셀 펠 릿 빨간색 이면 버퍼 솔루션 lysing 적혈구 세포 치료 (재료의 표 참조).
	<li>얼음에 50 mL 튜브</li> <ol>
		<li>붉은 혈액 세포를 lysing 버퍼의 5 mL을 추가.</li>
		<li>는 적혈구 세포를 완료 하려면 3-5 분 기다립니다. 시간 적혈구 오염 정도 따라 다릅니다.</li>
		<li>PBS의 20 mL를 추가 하 여 반응을 중지.</li>
		<li>원심 분리기에서 225 x g 실 온에서 5 분. 튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한 삭제. 
		참고: 선택 사항: 아래에 설명 된 RBC 세포 수행 하는 경우는 PBMCs 세척.</li>
	</ol></li> <li>워시 PBMCs: <ol><li>225 x g 실 온에서 5 분 동안에 20 mL의 PBS와 원심 분리기를 추가.</li>
		<li>튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한 삭제.</li>
	</ol></li> <li>다시 완전 한 α-MEM (1% 글루타민 (초기 농도 100 X)와 10% 태아 둔감 한 혈 청 보충)에 셀 중단.</li>
	<li>는 Neubauer 챔버와 셀을 계산합니다.
	<ol><li>빙 초 산에 샘플 1: 100 희석 및 희석의 10 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
		<li>두 번 이상 계산 및 계산 셀의 평균 총 수집을 복제의 의미.</li>
	</ol></li> <li>셀 접시: <ol><li>c m 2 당 750000 PBMCs의 농도에 세포 격판덮개.</li>
		<li>5% CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에 도금된 셀 저장. 
		참고: 디자인 셀 정상 완전 한 α-MEM MCSF 또는 RANKL GFs. 기억 하십시오 적어도 3 기술에서 수행 하는 각 조건 없이 함께 취급 되는 부정적인 컨트롤을 포함 하는 실험을 복제 합니다. 3 생물 복제 수행.</li>
	</ol></li> <li>GFs와 보완 매체 변경: <ol><li>셀 시드 후 약 3 h를 기다릴 한 다음 피 펫 (200-1000 µ L) 파편, 첨부 되지 않은 세포와 적혈구를 삭제 하 여 매체를 제거. 
		참고: 셀 분리를 피하기 위해 매체를 변경할 때 조심.</li>
		<li>추가 새로운 완전 한 α-MEM MCSF의 20 ng/mL으로 보충 (500 µ L/잘). 
		참고: 때 암 세포와 공동 경작, 씨 암 세포 PBMC 시드 후 하루.</li>
	</ol></li> <li>미디어 (α-MEM MCSF의 20 ng/mL로 보충) 2-3 일 마다 변경: <ol><li>200-1000 µ L 피 펫에 의해 매체를 폐기.</li>
		<li>200-1000 µ L 피 펫에 의해 추가 새로운 신선한 매체.</li>
	</ol></li> <li>셀 시드, 후 6-7 일 추가 20 ng/mL RANKL의 완전 한 α-MEM + MCSF.</li>
	<li>매체 변경 (완전 한 α-MEM + MCSF + RANKL) 매 2-3 일: <ol><li>200-1000 µ L 피 펫과 매체를 폐기.</li>
		<li>는 200-1000 µ L 피 펫과 새로운 매체를 추가합니다. 셀 시드 후 14 일 분화의 유도 중지.</li>
		<li>폐기 매체와 PBS로 두번 세척.</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde로 셀 수정: <ol><li>셀 건조 두고.</li>
		<li>추가 4 %paraformaldehyde (재료의 표 참조).</li>
		<li>실 온에서 20 분 동안 품.</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde 삭제와 PBS의 500 µ L로 두 번 세척. 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 장갑, 마스크와 안경을 착용 하십시오.</li>
	<li>건조 세포 허용.</li>
	<li>수행 트랩 제조 업체에 따라 얼룩 &#39; s 지침 (재료의 표 참조).</li>
	<li>수동으로 확대 10 배; 현미경 osteoclast 같은 셀의 개수 NA 0.30. 
	참고: Osteoclast 같은 셀 4 핵으로 트랩 + polycarion 셀으로 정의 됩니다.</li>
</ol> 2. 암 세포 배양 참고: SCP2 17, 트리플 부정적인 인간에서 발생 하는 osteotropic 셀 라인 등 유 방 선 암 세포 라인의 종류와 실험을 수행할 수 있습니다 유 방 암 세포 선 (MDA-MB-231), 그리고 호르몬 수용 체 양성 세포 선 MCF7.
<ol><li>75 cm 2 플라스 크에 단층으로 셀 문화.
	<ol><li>75 cm 2 플라스 크에 씨앗 1000000 암 세포.</li>
		<li>1% 글루타민과 10% 태아 둔감 한 혈 청 5% CO 2 분위기에서 보완 하는 완전 한 α-MEM 매체에서 37 ° C에서 셀 저장.</li>
	</ol></li> <li>약 90%의 confluency에서 셀 분리: <ol><li>매체 폐기, PBS, 세척 및 PBS에 트립 신 1 X의 2-3 mL를 추가.</li>
		<li>37에서 3-5 분에 대 한 셀을 품 어 ° c.</li>
		<li>10 mL 피 펫, 효소 반응을 중지를 완전 한 매체의 8 mL을 추가 하 여 75 cm 2 플라스 크에서 분리 된 세포를 수집.</li>
		<li>5 분에 대 한 225 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol></li> <li>암 세포 세척: <ol><li>PBS의 10 mL을 추가.</li>
		<li>5 분에 대 한 600 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol></li> <li>Neubauer 챔버와 암 세포를 계산.
	<ol><li>암 세포를 두 번 이상 계산 및 계산 셀의 평균 총 수집을 복제의 뜻.</li>
	</ol></li></ol> 3. 직접 암 세포의 공동 문화 nd Osteoclasts 향해 Monocytes 겪고 차별화 <ol><li>삽입 (기 공 직경 0.4 µ m)에서 암 세포를 씨앗: <ol><li>c m 2 당 4, 000 셀의 농도에 암 세포 씨.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO 2에서 품 어. 
		참고: 씨 암 세포 PBMC 0.4 µ m 삽입에 공동 문화 실험에 대 한 시드 후 날.</li>
	</ol></li> <li>준수를 셀 수 있도록 24 시간 대기.</li>
	<li>공동 문화 (1.10 부분의 프로토콜 참조)을 시작 하 되 문화 통해 문화를 삽입 하는 장소는 시드.</li>
	<li>미디어 완전 한 α-MEM와 2-3 일 마다 변경합니다.
	<ol><li>200-1000 µ L 피 펫과 매체를 폐기.</li>
		<li>추가 500 µ L 신선한 매체. 
		참고: 공동 문화의 기본 목표는 암 세포의 osteoclastogenic 힘을 이해 하는, 따라서, GFs는 추가 되지 않습니다 α-MEM에. 각 실험에서 공동 문화, ne 포함gative 컨트롤 (1.10 프로토콜의 단계에서 참고)와 osteoclasts RANKL과 MCSF (암 세포)로 분화의 긍정적인 컨트롤입니다. 암 세포는 단 세포에 배치 되지 삽입에 시드 공동 문화의 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>공동 문화를 중지 하 고 암 세포를 사용 하 여 다운스트림 분석: <ol><li>13 일 PBMC 시드 후와 암 세포를 뿌리기, 후 12 일 새로운 접시에 삽입 장소.</li>
		<li>중지 암 세포 배양은 기초 다운스트림 분석 (내용 참조)을 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>날 14, osteoclast 차별화를 중지 하 고 셀, 1.15 단계에서 보고 된 문제를 해결.</li>
	<li>수행 트랩 얼룩 즉시 또는 14-30 일 이내. 
	참고: 선택적 얼룩: 트랩 + polycarion 셀 osteoclasts는 것인지 연구 클릭률, osteoclast 특정 마커를 감지 추가 얼룩 수행할 수 있습니다. F-말라 반지의 발견은 다른 osteoclast 특정 얼룩 분석 결과 12 , , 13 14.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

모델 전 임상 시험관에 암 세포 및 뼈 세포 사이 누화의 메커니즘을 공부 하 고 새로운 치료 전략을 만드는 데 사용할 수 있는 뼈 전이의 메커니즘을 식별 하기 위해 필요 합니다. 우리는 모델을 완벽 하 게 인간의 생체 외에서 인간 주변 혈액 (그림 3)에서 osteoclastogenesis의 개발. 방법론의 최적화 하는 동안 중요 한 포인트의 번호 식별 하 고 해결 했다. 첫 번째 씨...

뼈 질병1,2,3의 과정에서 뼈 전이 개발 하는 환자의 20-25%와 폐, 유 방, 전립선 암, 등 기본 종양의 종류에 대 한 전이의 일반적인 사이트입니다. 특히, 유 방 암 환자의 70% 죽음4에서 뼈 전이의 증거를가지고. 종양 및 stromal 세포 상호 작용은 암 진행에 필수적인 기본 암에 보조 병 변. 뼈 microenvironment에서 유방암에서 osteolytic 뼈 전이 암 세포, 뼈 세포, 뼈 microenvironment 사이 발생 하는 병 적인 악순환의 설립에 따라 달라 집니다. 암 세포 뼈 재흡수5,,67증가 뼈 균형을 방해.
정상 및 병 적인 조건에서 osteoclasts는 뼈 재흡수에 대 한 책임 셀 반면 osteoblasts, 입금 새로운 매트릭스에 새로운 뼈 대형8에 대 한 책임이 있습니다. Osteoclast 활동 RANKL, 사전 osteoclast 표면에 그것의 수용 체 순위를 바인딩하는 사전 osteoclast 퓨전, 차별화 성숙한 osteoclasts에 필요한 과정을 유도의 표현을 통해 osteoblasts에 의해 통제 된다. Osteoclastogenesis의 유도 뼈 재흡수를 증가합니다. Vivo에서 연구의 많은 수는 크게 뼈 전이 형성9,,1011의 우리의 이해를 개선 했다. 유방암 세포 주 종양에서와 뼈 microenvironment에서 osteoclastogenesis 홍보 뼈 항상성 교란 하 고 뼈 재흡수8. 이 시나리오에서는 모든 분자 사이 상호 작용에 발생 하는 암 세포와 osteoclasts에 중요 한 중요성의. 이미 언급 했 듯이, vivo에서 쥐 모델에서 뼈 전이 형성의 메커니즘을 해명 되었습니다 했습니다. 그러나, 모든 vivo에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인에 대 한 필요, 이외에 높은 비용 및 시간이 걸리는 방법을 포함 vivo에서 실험을 수행 하는 것 다른 몇 가지 단점이 있다. 몇몇 저자는 사전 osteoclasts 라는 RAW246.79,,1011의 murine 라인을 사용 하 여 osteoclastogenesis의 전 임상 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델을 결합 했다. 이 모델의 단점이 사실 셀 이미 사전 osteoclasts 되기 위해 최선을 다하고 있습니다 및 인간 근원의 하지 않습니다에서 줄기. 이러한 이유로, 변환 연구는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델의 뼈 암 세포 상호 작용을 공부 하 여부에서 크게 유익할 수 있었다.
우리 osteoclastogenesis에서 생체 외에서 인간 주변 혈액 샘플12,13에서 시작 하는 방법을 최적화 합니다. Osteoclasts는 monocytes는 존재, 이기는 하지만 작은 정도에, 말 초 혈액 샘플에서에서 파생. 단 세포는 먼저 구분 granulocytes 전체 혈액에 존재 하 고 적혈구에서 Ficoll 밀도 기울기; 그들은 다음 세포와 달리 플라스틱 기판에 그들의 능력 덕분에 선택 됩니다. 시드, 후 셀 14 일 동안 교양. MCSF 및 RANKL GFs monocytes에 먼저 대 식 세포로 그리고 osteoclasts14,15차별화 하는 데 필요한 있습니다. RANKL은 osteoclastogenesis의 후반 단계에서 분화 과정을 유도 하는 데 사용 됩니다 반면 MCSF의 분석 결과, 전체 기간 동안 필요 합니다. 차별화의 초기 단계에서 MCSF monocytes 증식 및14,15살아남을 수 있습니다. Osteoclastogenesis의 두 번째 부분에서, 세포 융합 및 osteoclasts, 고리에 걸 F의 특성 분포를 보여 주는 및 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정), 칼 시 토 닌 수용 체 등 특정 마커를 표현으로 성숙 (CTR) 14 , 15. 우리의 방법을 일 7 ~ 14에서에서 실험 및 MCSF와 RANKL의 첫 번째 7 일 동안 monocyte 문화에 MCSF를 추가 구성 됩니다. 실험의 끝에, osteoclastogenesis로 아래 차별화 된 셀을 계산 하 여 분석 된다.
GFs에 의해 분화를 유도 하는 monocyte 문화는 우리의 전 임상 모델의 기초를 형성 한다. 우리 유방암 세포의 osteoclastogenic 힘을 더 잘 이해 하는 GFs 없이 공동 문화 시스템 최적화. 우리가 먼저 개발 간접 공동 문화 매체를 추가 하 여 (80% α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 20% 조절 매체에서에서 수집 된 유방암 세포의 문화는 했다 셀에 약 90% 합칠 겪고 차별화12 . (혈 청 부족 조건 하에서 수집 되지 않습니다) 바른된 매체 24 시간 후 수집 된 고 1: 4의 비율에 신선한 매체와 혼합. 바른된 매체 부정적인 제어에 관하여 상당한 osteoclast 차별화를 유도 한다. 그러나, 암 세포 및 뼈 세포 간의 상호 상호 작용에 대 한 정보는 손실 간접 공동 문화를 사용 하는 경우, 우리는 개선 우리의 시스템 직접 공동 문화를 수행 하 여. 우리는 0.4 µ M 삽입 및 단 세포 도금 했다 우물에 그들을 배치에서 암 세포를 시드. 이 메서드를 사용 하 여 셀 같은 매체를 공유 하 고 분 비 단백질을 교환 한다. 우리는 따라서 osteoclastogenesis 암 세포13에 의해 유도 된의 완전히 인간의 전 임상 모델을 만들었습니다.
이 시스템은 매우 다재 다능 하 고 다른 연구 목적, 예를 들면, 뼈 전이에 약물의 역할을 조사 하는 약리 연구에 사용 될 수 있습니다. 우리의 모델 효능과 뼈-타겟 요법 암 세포13의 뼈 microenvironment에 antitumor 약물의 행동의 메커니즘을 연구를 가능 하 게. 올바른 컨트롤 실험 설계, 즉, 암 세포와 개별적으로 경작 osteoclasts 쉽게 마약 활동에 공동 문화에 미치는 영향을 이해 하는 것 있습니다. 이 이렇게 공부 되 고 마약 대상 모두 암 세포와, 예를 들어, osteoclasts everolimus16때 더욱 흥미로운 됩니다. 이 모델은 또한 암 세포 및 뼈 세포 사이 상호 작용의 새로운 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Euroclone</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life-technologies</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life-technologies</td><td>ECS0180DPR</td><td></td></tr><tr><td>hMCSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Storage indications must be respected</td></tr><tr><td>hRANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>Storage indications must be respected</td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387 A</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte separation media</td><td>Biowest</td><td>L0560-100</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood cell lysing buffer</td><td>SIgma</td><td>11814389001&lt;br/&gt; ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>COD.&lt;br/&gt; ECB3052D</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-267</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3470-Clear</td><td>These inserts are for 24-well plates;&lt;br/&gt; 6.5 mm, 0.4 &amp;mu;M;&lt;br/&gt; pore size</td></tr></tbody></table>

development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines

종양 세포 및 뼈 세포 뼈 microenvironment에서 사이 누화 뼈 전이 형성의 메커니즘 이해 결정적 이다. 우리는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델을 유방암 세포 및 osteoclasts로 차별화를 진행 하는 monocytes의 공동 문화를 개발 했다. 우리는 주변 혈액 건강 한 기증자 로부터 수집 된 샘플에서 시작 하는 osteoclastogenesis의 모델을 최적화. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 처음 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 분리, 높은 밀도에서 시드 되었고 두 성장 인자 (GFs)을 추가 하 여 차별화 하는 유도: 핵 요인-κB ligand (RANKL) 및 대 식 세포의 수용 체 활성 콜로 니 자극 인자 (MCSF). 셀은 14 일 문화에 남아 다음 고정 고 다운스트림 분석 하 여 분석. Osteolytic 뼈 전이에 뼈에 암 세포 도착의 효과 중 하나는 osteoclastogenesis의 유도 이다. 우리는 따라서 GFs와 관련 하 여 암 세포의 분화 능력 연구 유방암 세포의 공동 문화 우리의 모델 도전. 암 세포 osteoclast 상호 작용을 공부 하는 간단한 방법 간접 공동 문화 조절된 매체 유 방 암 세포 배양에서 수집 하 고 신선한 매체와 혼합의 사용에 따라 수행 하는 것입니다. 이 혼합물 다음 osteoclast 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 우리는 또한 직접 공동 문화는 암에서 세포, monocytes 분화를 겪고 매체 공유와 분 비 요소를 교환 하는 방법을 최적화 합니다. 이것은 상당한 개선을 원래 간접 공동 문화 메서드를 통해 연구자는 두 종류의 세포 상호 작용을 관찰 하 고 암 세포와 osteoclasts 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 유방암에서 파생 된 씨 셀 라인을 전이성 뼈 microenvironment에 약물의 효과 연구 수 있습니다. 모델도 골다공증 또는 다른 뼈 조건 등 다른 질병 연구를 사용할 수 있습니다.

메서드는 쉽게 인간의 말 초 혈액에 monocytes osteoclasts를 구별 하기 위해 최적화 되었다. Monocyte 문화 암 세포, 암 세포의 뼈 전이에 osteoclastogenesis를 유지 할 수 있다 (문학18에서 같이) 확인을 경작 했다. Osteoclasts 암 세포에서 분화 하 고 GFs는 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclast 같은 셀 있는 셀 4 이상의 핵 이며 트랩 (보라색 세포를) 얼룩...

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Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

development-human-preclinical-model-osteoclastogenesis-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

연구

암 연구학

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

발생학

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

의학

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구의 분화

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

면역학 및 감염병학

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

생물학

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases (e.g., osteoporosis and bone cancer) and are therefore important objects of research. In vitro, their activity can be analyzed by the formation of resorption pits. In this protocol, we describe a simple pit assay method using calcium phosphate (CaP) coated cell culture plates, which can be easily visualized and quantified. Osteoclast precursors derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured on the coated plates in the presence of osteoclastogenic stimuli. After 9 days of incubation, osteoclasts were fixed and stained for fluorescence imaging while the CaP coating was counterstained by calcein. To quantify the resorbed area, the CaP coating on plates was stained with 5% AgNO3 and visualized by brightfield imaging. The resorption pit area was quantified using ImageJ.

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Here, we present a simple and effective assay procedure for resorption pit assays using calcium phosphate coated cell culture plates.

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

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