이 방법은 췌장암 중 세포독성 T 세포 반응에 영향을 미치거나 보강하는 새로운 치료제 또는 전략을 어떻게 내세하는데 사용될 수 있다. 이 기술은 종양이 시험관 내에서 빠르게 소화되고 자극될 수 있게 해주며, T 세포 반응의 여러 파라미터를 동시에 분석할 수 있게 하여 다른 응용 분야에 쉽게 적응할 수 있습니다. 시작하려면 집게를 사용하여 종양을 페트리 접시에 옮긴다.
효소 활동이 재발하는 것을 방지하기 위해 50 밀리리터 튜브에 5 밀리리터의 소화 배지를 얼음에 보관하십시오. 페트리 접시에 종양을 커버하기 위해,이 솔루션의 작은 알리쿼트걸릴. 멸균 메스와 집게를 사용하여 종양을 길이가 약 3밀리미터 미만인 작은 조각으로 자른다.
종양 조각을 튜브에 긁어 내고 모든 조각이 소화 매체에 잠길 때까지 튜브를 부드럽게 반전시십시오. 소화하기 위해 섭씨 37도에서 20 분 동안 흔들리는 장치에 튜브를 옮기. 종양의 모든 조각이 침수되어 튜브의 가장자리에 붙어 있지 않은지 확인하십시오.
소화 단계 직후, 튜브를 얼음에 놓고 효소 활성을 늦출 수 있습니다. EDTA를 추가하여 20 밀리몰러의 최종 농도를 달성하고 효소 활성을 더욱 늦추기 위해 샘플을 잠시 소용돌이시다. 튜브를 열고 신선한 RPMI 배지로 튜브의 뚜껑에서 종양 소화를 헹돕시 헹짝 헹노십시오.
그런 다음 70 미크론 여과기를 준비하고 얼음 위에 50 밀리리터 오픈 튜브에 놓습니다. 필터를 중간 크기로 미리 적시합니다. 소화된 세포를 다시 중단하고 25 밀리리터 또는 더 큰 스트립을 사용하여 튜브의 측면을 씻으십시오.
스트립의 넓은 개구부로 두꺼운 소화가 쉽게 통과할 수 있습니다. 25 밀리리터 스트리펫을 사용하여 모든 소화를 스트레이너로 옮기습니다. 1 밀리리터 주사기 플런저를 사용하여 필터 위에 종양을 위아래로 매시합니다.
RPMI로 여과기를 통해 세포를 지속적으로 세척합니다. 세포를 밀어 낼 수 있는 충분한 힘으로 씻어야 합니다. 모든 세포가 여과기를 통과할 때까지 계속 세척하십시오.
300회 G, 섭씨 4도에서 5분간 튜브원심분리합니다. 조심스럽게 세포 펠릿을 다시 중단하고 RPMI를 완료하고 다른 필터를 직접 통과하여 세포 외 매트릭스 또는 적절하게 다시 중단 할 수없는 큰 세포 덩어리를 제거합니다. 자극이 필요하지 않은 경우, 즉시 유동 세포 분석에 대한 격리 된 세포를 얼룩, 또는 10 %DMSO 및 FBS의 동결 배지에서 다시 중단, 영하 80섭씨에 저장.
자극을 수행하려면 먼저 셀을 계산합니다. 100 마이크로리터 당 6에 2 배 10의 농도를 달성하기 위해 전체 매체에서 세포를 희석. U-바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포의 100 마이크로 리터를 플레이트.
PMA 및 이오노마이신의 2X 준비를 포함하는 완전한 매체의 100 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에 인큐베이터에 놓지만 이산화탄소는 1시간 동안 5%입니다. 이어서, 브레펠딘 A와 모넨신의 10X 제제의 20 마이크로리터에서, 그리고 각각 1.06 마이크로몰라 및 2.0 마이크로몰라의 최종 농도를 달성하기 위한 완전한 매체.
접시를 인큐베이터에 4시간 더 넣습니다. 췌장에 1000 TB32048 세포를 주입 한 후, 치열 토성 종양은 개발하는 데 약 30 일이 소요됩니다. 수확된 치열토성 종양의 소화 및 자극 후, 발갈을 위한 배경 형광을 결정하기 위해 형광을 뺀 1개.
그리고 브레펠딘 A 모넨신 만 제어는 사이토카인의 기저 생산을 결정하기 위해 수행되었다. 브레펠딘 A와 모넨신을 가진 인터페론 감마 잠복식의 경우, 비장과 종양 샘플 모두에서 FMO 제어를 통해 인터페론 감마의 증가가 발생하지 않았습니다. 그러나, PMA 와 이오노마이신의 첨가는, 비장 및 종양 유래 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 모두에서 검출가능한 세포내 인터페론 감마의 비율을 증가시켰습니다.
양성 조절으로 사용되는 비장 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포는 종양 침투 T 세포 서브세트보다 상대적으로 높은 인터페론 감마 생산을 갖는다. 면역 억제를 나타내는 것은 종양 내에서 발생합니다. TNF 알파에 대 한 동일한 전략을 사용 하 여, 비장 CD4 양성 T 세포의 높은 백분율 은 세포 내 TNF 알파에 대 한 긍정적인 했다.
종양 침투 CD4 양성 T 세포에 비해. 비장 및 종양 침투 CD8 양성 T 세포, TNF 알파의 유사한 수준을 생산. 종양이 충분히 다진지 확인하고 모든 조각이 소화 매체에 잠겨 있는지 확인하십시오.
종양을 분쇄 할 때, 부드럽게해야하고 철저하게 세포를 씻어해야합니다. 종양 소화 프로토콜은 유동 보조 세포 분류와 결합될 수 있으며, 개별 면역 세포 하위 집합을 정화하여 추가, 기능적 또는 유전자 발현 분석을 위한 것입니다. 우리는 B 세포가 췌장암 도중 면역 반응을 형성하는 방법을 특성화하기 위하여 이 방법을 이용했습니다, B 세포 녹아웃 및 B 세포 고갈마우스 둘 다에 있는 직교 종양을 생성합니다.
