이 프로토콜은 기능적 분석 및 현상 특성화를 사용하여 강력한 방식으로 암 줄기 세포의 식별 및 격리를 허용합니다. 종양 샘플에서 암 줄기 세포 격리는 개별 종양에 특정 치료의 임상 적용을 안내하기위한 플랫폼이 될 수 있습니다, 저항을 예측하고 결과적으로 재발. 비 부착 현탁액 배양을 준비하기 위해 먼저 50 마이크로 리터의 센티미터곱으로 세포 배양 용기를 폴리헤마 밀리리터 당 15 밀리그램으로 코팅하고 용기를 37섭씨 건조 오븐에 적어도 2 일 동안 배치하십시오.
용기가 완전히 건조되면 PBS로 80 ~90 %의 응류 암 세포 주 배양으로 세척하고 트립신 EDTA의 1 ~ 2 밀리리터로 세포를 분리하십시오. 섭씨 37도에서 5분 후, 신선한 세포 배양 배지의 2~4밀리리터로 반응을 체포하고 원심분리에 의해 해리된 세포를 세척한다. 계산을 위한 신선한 배양 배지에서 펠릿을 다시 중단하고, 배양식 접시 농도당 500~2000세포에서 메틸 셀룰로오스 2%를 함유한 신선한 구체 배양 배지에서 세포를 희석한다.
구단결도를 보장하기 위해 각 셀라인을 앵커리지 없는 환경에서 저밀도로 시드합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 5일 배양시 폴리헤마 코팅 플레이트에 시드하여 표피 성장 인자의 밀리리터당 10나노그램, 기본 섬유아세포 성장 인자의 밀리리터당 10나노그램을 세포 배양 배지에 2일마다 첨가하였다. 도금 후 3~12일 후에는 3차원 볼 모양의 세포 식민지를 가벼운 현미경 검사법에 의해 관찰해야 합니다.
유래된 신봉체 집단을 얻기 위하여, 구체를 원래 암 세포주에 적합한 배양 조건하에서 새로운 배양 접시로 이송한다. 1~2일 의 배양 후, 세포 단층은 기원의 세포주와 유사한 형태를 가진 부착구 주위에서 성장하는 것을 관찰해야 한다. 관심있는 암 세포선의 구 형성 능력을 결정하기 위해, 구 형성 프로토콜의 완료 후, 원심 분리에 의해 구체를 수집.
신선한 매체에서 구펠릿을 부드럽게 재축하고 혈종계를 사용하여 직경이 40 마이크로미터를 초과하는 구체 수를 계산합니다. 그런 다음 처음에 도금된 셀 수에 비해 얻어진 구의 백분율 비율을 계산합니다. 관심 있는 세포주의의 자기 갱신 능력을 결정하기 위하여는, 원심분리에 의하여 구체를 수집하고 37섭씨에서 5 분 잠복에 대한 트립신 EDTA에 있는 구 펠릿을 부드럽게 재놓습니다.
인큐베이션의 끝에서, 튜브에 효소 및 활성화 배지를 추가하고, 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 용액을 파이펫한다. 혈류계와 트라이판 블루 배제 방법을 사용하여, 서스펜션에서 실행 가능한 세포를 계산하고 단지 입증된 바와 같이 구형성 분석법을 위해 다HEMA 코팅 판에서 세포를 플레이트한다. 8일 후, 혈류계를 사용하여 직경이 40마이크로미터 이상인 구체 수를 계산하고, 처음에 도금된 세포의 수에 비해 얻어진 구체의 비율을 계산한다.
구체가 차지하는 영역을 평가하기 위해 배양 접시를 이미지 획득 모듈이 장착된 반전 된 현미경의 단계에 배치하고 100X ~ 400X 배율을 선택합니다. 조건당 최소 10개의 임의 필드의 이미지를 가져오고 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 구체 주변의 관심 영역을 그립니다. 그런 다음 픽셀에 대한 관심있는 각 영역의 영역을 측정하고 측정 된 픽셀의 평균 영역으로 구 투영 영역을 계산합니다.
암 줄기세포의 구 형성 능력, 자가 재생 및 투영 영역의 기능적 특성화는 원기 의 먼 혈통 및 조직의 비교를 허용한다. 구체 형성 프로토콜은 구형 식민지가 몇몇 자궁내막 및 유방암 세포주에서 정지에서 또는 인간 종양 견본에서 조직의 온화한 효소 소화 후에 수득될 수 있습니다. 자궁내막과 유방암 구체는 도금 후 1~2일 후에 기원의 세포줄에 유사한 형태를 가진 세포 단층을 초래합니다.
이러한 대표적인 실험에서, 호르몬 수용체 양성 유방암 MCF-7 세포는 트리플 음성 HCC1806 유방암 세포보다 더 높은 구체 형성 능력, 자기 재생 능력 및 프로젝션 영역을 입증하였다. 구체 형성 프로토콜을 통한 암 줄기 세포 농축 외에도 유동 세포측정과 같은 보완적인 방법을 사용하여 줄기에 대한 추가 평가를 권장합니다. 자궁내막 세포주로부터 수득된 구체의 대표적인 분석에서, 암 줄기세포 마커를 발현하는 세포의 4개 집단은 혈류 세포측정에 의해 각 세포주에서 확인되었다.
다른 분자 생물학 기술에 의한 종양 구체의 평가는 암 줄기 세포의 줄기 및 가소성을 확인할 수 있으며 표적 치료의 개발을 촉진할 수 있다. 부드러운 구체 수확 후 서양 얼룩 분석은 또한 체외 생성 구체에 대한 암 줄기 세포 표현형을 밝혀. 이 격리 프로토콜은 임상적으로 재발, 전이 및 치료 저항을 이해하는 것으로 변환되는 암 줄기 세포 중요성에 대한 우리의 이해에 기여합니다.
