그렇다면이 프로토콜이 중요한 이유는 무엇입니까? 음, 뇌 전이는 치료하기가 매우 어려우며이 프로토콜은 최소한의 두개 외 종양이있는 임상 적으로 관련된 마우스 모델을 생성합니다. 이 기술은 약물 분포 및 두개 내 종양의 반응을 객관적으로 분석 할 수있게합니다.
이 기술의 주요 장점은 모델이 재현성이 높고 주사 후 비교적 짧은 시간에 뇌 전이가 발생한다는 것입니다. 질병 진행은 동물간에 유사하므로 연구자가 실험, 치료 일정 및 종점을 더 쉽게 표준화 할 수 있습니다. 초보자를위한 나의 조언은 해부 현미경을 통해 보면서 집게와 주사기를 사용하여 목 주위의 해부학 적 랜드 마크에 익숙해지고 수의사가있는 곳에서 프로토콜을 연습하는 것입니다.
BT-474 암세포를 10 밀리리터의 완전한 성장 배지를 사용하여 T-75 플라스크에 6 개의 세포에 10 배의 2 배 밀도로 파종하고 세포가 주입 전에 70-80 %의 컨플루언시에 도달 할 때까지 배양합니다. 주입 당일에 성장 배지를 버리고 세포 단층을 PBS로 두 번 세척하고 예열 된 세포 배양 해리 시약 5 밀리리터를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 배양합니다.
5분 후 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 부드럽게 두드려 세포 분리를 돕습니다. 해리 시약 활성을 담금질하기 위해 10%FBS를 포함하는 완전한 성장 배지 5밀리리터를 추가합니다. 세포 덩어리를 줄이기 위해 피펫팅으로 용액에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.
세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 180G에서 원심 분리합니다. 상청액을 따라 내고 세포 응집을 최소화하기 위해 칼슘과 마그네슘없이 10ml의 HBSSS에 세포 펠릿을 재현탁하십시오. 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 180 G에서 원심분리하여 상청액을 디캔트하여 잔류 혈청 또는 해리 시약을 제거하고 세포 펠렛을 HBSS 3밀리리터에 재현탁시킨다.
새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브에 100마이크로미터 세포 여과기를 놓고 세포 현탁액을 통과시켜 세포 덩어리를 제거합니다. 트리판 블루를 사용하여 생존 세포의 수를 계산하고, 세포 현탁액을 HBSS로 희석하여 밀리리터당 6개의 세포에 10배한 2.5배의 세포 농도로 희석한다. 튜브를 얼음 위에서 수평으로 유지하고 튜브를 주기적으로 부드럽게 흔들어 덩어리를 최소화하십시오.
세포 현탁액은 최대 6시간 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 식별을위한 귀 펀치 마우스와 전기 클리퍼를 사용하여 목 부위의 모피를 면도합니다. 테이프를 사용하여 노출 된 피부에서 과도한 모발을 청소하십시오.
건조를 방지하기 위해 눈에 안구 윤활제를 바르십시오. 수술 보드에 테이프로 붙인 실을 사용하여 위 앞니를 걸고 앞다리와 뒷다리를 테이핑하여 마우스를 부드럽게 고정합니다. 이 단계는 몸을 확장하고 절차 중에 목을 똑바로 유지합니다.
수술 전 피부 준비를 위해 포비돈 요오드와 같은 국소 방부제로 목을 닦아 피부 미생물 부하를 줄이고 느슨한 모발을 제거하십시오. 절개 부위의 재 오염을 방지하기 위해 바깥쪽으로 작업하면서 피부 중앙에서 청소하십시오. 70 % 에탄올을 사용하여 과정을 반복하고 소독을 위해 요오드와 에탄올을 세 번 번갈아 가며 수행하십시오.
절차를 계속하기 전에 마취 사망을 보장하기 위해 핀치 테스트를 통해 반사를 확인하십시오. 동물 위에 멸균 수술 드레이프를 놓습니다. 해부 현미경에서 턱 아래 5mm에서 흉부 입구까지 가위를 사용하여 마우스 목 부위의 정중선을 따라 수직 15mm 절개를합니다.
두 쌍의 각진 집게를 사용하여 피부와 밑에있는 타액선을 분리하고 견인기를 적용하여 기관이 노출 된 상태로 유지합니다. 두 쌍의 미세한 각도의 집게를 사용하여 기관에 인접한 근육과 지방 조직을 무뚝뚝하게 해부하여 오른쪽 경동맥 덮개를 노출시킵니다. 경동맥은 총 경동맥, 정맥 및 미주 신경을 덮고있는 섬유질 층이며,이 번들은 밝은 빨간색 총 경동맥으로 시각화 할 수 있습니다.
주변 근막의 경동맥 분기점까지 총 경동맥 꼬리의 일부를 제거하고 미주 신경 및 정맥에서 분리하십시오. 주변 신경과 근막에서 경동맥 분기점을 분리하고 제거하십시오. 외부 경동맥 아래에 미세한 집게를 배치하고 동맥 아래에 5-0 실크 봉합사를 통과시킵니다.
매듭을 짓고 봉합사를 조이고 여분의 선을 자릅니다. 총 경동맥 아래에 미세한 집게를 배치하고 동맥 아래에 5-0 실크 봉합사를 통과시킵니다. 매듭을 묶고 제안 된 주사 부위 근처의 위치에서 봉합사를 조입니다.
초과 봉합사를 자르고 약 10 밀리미터의 선을 남겨 둡니다. 보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 스트립을 약 10x5mm 정도 자르고 축축하게 합니다. 스트립을 접어서 제안 된 주사 부위의 경동맥 아래에 놓습니다.
이것은 주사하는 동안 혈관을지지합니다. 제안 된 주사 부위의 총 경동맥 주둥이에서 느슨한 매듭으로 세 번째 결찰을 놓습니다. 이것은 주입 후에 만 조여집니다.
세포 현탁액을 부드럽게 교반하고 200 마이크로 리터의 세포 현탁액을 31 게이지 바늘로 인슐린 주사기에 넣습니다. 활성화 풋 페달에 연결된 주사기 드라이버에 주사기를 넣습니다. 31 게이지 바늘이있는 미세한 캐뉼러를 주사기에 부착하고 라인을 프라이밍합니다.
경동맥이 잘 배치되고 가압되어 있는지 확인하십시오. 두 개의 가는 각도의 집게를 사용하여 하나는 첫 번째 합자 끝에 부드럽게 장력을 가하고 다른 하나는 31게이지 바늘을 잡고 베벨이 있는 바늘을 혈관 내강에 천천히 삽입하여 구멍이 뚫리지 않도록 주의합니다. 이전에 준비한 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 초당 10 마이크로 리터의 속도로 총 경동맥에 천천히 주입합니다.
이것은 5 번째 세포에 10의 2.5 배를 혈관 내로 전달할 것입니다. 성공적인 주사는 경동맥 혈관에서 혈액을 제거하여 시각화 할 수 있습니다. 역류와 출혈을 방지하기 위해 바늘을 뺀 직후 느슨한 합자를 부드럽게 들어 올리고 조입니다.
과도한 봉합사를 다듬고 축축한 보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 조각을 제거하십시오. P-200 피펫을 사용하여 150-200 마이크로 리터의 멸균 수 또는 식염수로 수술실을 두 번 헹굽니다. 출혈을 확인한 후 연조직, 타액선 및 피부를 경동맥과 기관 위의 위치로 바꿉니다.
봉합사 바늘 홀더, 겸자 및 흡수성 또는 비흡수성 6-0 모노필라멘트 봉합사를 연속적인 패턴으로 사용하여 절개의 피부층을 닫습니다. 수술 후 통증 완화로 피하 주사를 통해 부 프레 노르 핀 킬로그램 당 50 마이크로 그램과 멜 록시 캄 킬로그램 당 1 밀리그램을 주사하십시오. 마취에서 회복하기 위해 동물을 따뜻하고 깨끗한 새장으로 옮기십시오.
렉틴은 외부 경동맥 결찰의 유무에 관계없이 마우스의 총 경동맥에 주사되었습니다. 외부 경동맥이 결찰되었을 때 뺨 조직에서 렉틴의 감소가 관찰되었습니다. 결과는 결찰이 뇌 전달에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다.
종양 진행은 루시페라아제-발현, HER2-증폭된 유방암 세포주를 사용하여 모니터링하였다. BT474 뇌 전이 모델은 내부 경동맥 주사 후 5주차부터 생체발광 신호의 증가를 나타내었고, 그 후 점진적으로 성장하였다. 5 주에서 8 주 사이에 이질적인 신호 강도는 복잡한 유체 관류가있는 두개 내 종양을 나타 냈습니다.
종양 영역 내의 가돌리늄 농도는 혈액 순환에서 종양 조직으로 누출됨에 따라 증가했습니다. 나노의학의 축적과 뇌 전이는 BT-474 마우스에서 관련되지 않은 뇌 영역에 비해 종양 영역에서 더 높은 나노의학 수준이 검출됨으로써 확인되었습니다. BT-474 뇌 전이 모델이 진행됨에 따라 동물은 체중이 최대 20%까지 감소하기 시작하여 주사 후 평균 생존 시간이 9주가 되었습니다.
조직학 결과는 종양이 일방적으로 위치하여 종양이 대부분 고체, 독방 덩어리로 나타나는 경동맥 주사 부위와 일치한다는 것을 보여주었습니다. 빈 공간의 주머니가 자주 관찰되었고 괴사 세포로 구성되었으며 일부 동물에는 더 작은 파생물이 존재했습니다. 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 바늘을 삽입하기 전에 경동맥을 올바르게 준비하고 배치 한 다음 바늘을 삽입하는 동안 적절한 장력을 가하는 것입니다.
이 모델은 뇌로의 약물 전달과 뇌 전이 치료를 위한 새로운 치료제의 효능을 탐구하는 연구자에게 유용합니다.
