이 작품은 NIH (U54HD41857 및 PL1EB008542, Oncofertility 컨소시엄 로드맵 부여 이내 P30 Biomaterials 코어)에 의해 재정 지원되었다.

1. 소낭 절연 동물 실험은 노스웨스턴 대학에서 지침과 규정을 건강 가이드의 국립 연구소에 의해 규정된 실험실 동물의 관리 및 사용과 설립 기관 동물 사용 및 관리 프로토콜에 따라 수행되었다. 최적의 결과를 들어, 모든 해부는 세균 오염을 최소화하기 위해 37 °의 온도 제어를위한 C 가열 단계, 그리고 깨끗한 벤치에, CO 2의 주위 수준에서 산도 컨트롤에 대한 L15 미디어 실시하고 있습니다. 해부 미디어 (DM)는 50 IU / ML 페니실린 50 ML / μL 스트렙토 마이신, 1 % FBS와 보충 L15 매체와 준비가되어 있습니다. 유지 보수 미디어 (MM)는 50 IU / ML 페니실린 50 ML / μL 스트렙토 마이신, 1 % FBS와 보충 αMEM 매체와 준비가되어 있습니다. <ol><li> 0.1 % Collagenase와 0.1 % DNase를 포함 1-2 ML의 MM 가진 새로운 35mm 페트리 접시에 16일 오래된 마우스 갓 해부 난소를 전송합니다. 37 ° C와 5% CO 2 배양기 안에서 15 분 동안 품어. </li><li> 부화 후 collagenase를 제거한 다음 새로운 DM과​​ 35mm 페트리 접시에 전송하는 DM 몇 가지 세척 단계를 수행합니다. 부드럽게 일회용 주사기에 연결된이 28 8분의 5 게이지 바늘을 사용하여 전체 난소에서 (또는 절삭) 모공 거리 flicking하여 난소에서 모공 분리. 뿌리의 무결성을 손상하지 않고 가능한 한 많은 기질로 제거합니다. 난소 당 20-40 보조 모공 (130~150mm)을 해부하다. 이러한 모공은 보통 체세포로부터 2-3 레이어를했습니다. </li><li> 60mm IVF (체외 수정을)를 페트리 접시 및 외륜 3 ML의 MM 잘 중앙 1 ML의 MM을 추가합니다. 간단히 린스로 IVF 요리의 외륜에 피펫과 함께 그대로 모공을 전송하고, 다음 선택 (1.4 참조) 중앙에 잘 그들을 전송합니다. 인큐베이터에서 IVF 요리를 저장합니다. </li><li> 모든 모공이 수집된 후 선택 단계는 5 배속 배율과 해부 현미경으로 수행됩니다. 건강한 머리카락은 다음과 형태학의 특성을 가지고 : <ul><li> 2-3 체세포 레이어 </li><li> 130~150mm </li><li> oocyte와 체세포 사이에 분리도 </li><li> 온전하고 라운드 oocytes 캡슐화위한 IVF 요리의 중심지로 건강한 모공을 전송합니다. </li></ul></li></ol> 2. 뿌리의 캡슐화, 방법 1 - &quot;드롭 방법&quot; <ol><li> 중간에 잘 IVF 요리의 40 MM CaCl 2 TBS에서 50 IU / ML 트롬빈 1 ML을 추가합니다. 해동 얼음에 피브리노겐 주식 (TBS에서 50 MG / ML)를 유지. 바로 사용하기 전에 실온에 섬유소를 가져와. </li><li> 혼합 1X PBS, 0.5 % PBS 솔루션 알지네이트요 50 1.7 ML 살균 microcentrifuge 관에서 2시 1분 1초 비율 MG / ML의 피브리노겐 솔루션 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션을 준비합니다. 솔루션에 거품을 도입하지 마십시오. 부드럽게 와동과 스핀 다운. 이 솔루션은 약간 뿌연 나타나고 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다. </li><li> 플레이스 피브리노겐 / IVF 요리의 외륜의 알지네이트요 솔루션의 두 방울 : 캡슐화 및 세탁 10 μL 비말을위한 90 μL 소적. 증발을 감소하려면, 해부 현미경에서 가열 단계를 끄십시오. 200 μm의의 micropipette 팁, 그리고 신속하게 믹스를 사용하여 문화 미디어 (&lt;5 μL)의 최소 금액과 함께 10 μL 비말로 전송 10-15 모공. 최소한 첫 번째 드롭에서 솔루션의 금액 (&lt;5 μL)와 혼합과 90 μL 비말로 머리카락을 모두 전송합니다. </li><li> 동시에 한 뿌리와 IVF 요리에 트롬빈 / CA 2 + 용액에 10 μL 피펫 팁, 그리고 릴리스를 사용하는 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션의 5 μL를 대기음. 모든 모공이 캡슐 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 크로스 링크 트롬빈 / CA 2 + 솔루션 5-7분위한 비즈. 구슬은 섬유소의 젤로 어두운 될 것입니다. 먼저 어두운 비즈로 시작, 페트리 접시 포함 MM에 비즈를 전송합니다. 남은 트롬빈을 씻어하는 15-30분 기계가 보육을 위해 요리를 품다. </li><li> 즉시 100 대과 성장 미디어 μL 및 이미지를 포함하는 96 잘 문화 판에 구슬을 전송합니다. 성장 미디어 (GM)이 재조합 FSH 10 mIU / ML, BSA 3 MG / ML로 보충 αMEM 미디어와 함께 준비 1 MG / 소 fetuin 5 인슐린 μg / ML, 5 μg / 트랜스페린의 ML의 ML, 5 NG / 셀레늄의 ML. </li></ol> 3. 뿌리의 캡슐화, 방법 2 - &quot;Parafilm 방법&quot; <ol><li> 1.7 ML 살균 microcentrifuge 관에서 1:1 비율로 0.5 % 알지네이트요 솔루션 50 MG / ML의 피브리노겐 솔루션을 혼합하여 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션을 준비합니다. </li><li> 3mm 스페이서와 parafilm 코팅 유리 슬라이드에 피브리노겐 / 알지네이트요 혼합물의 피펫 7.5 μL 방울. minima 각 드롭에 한 뿌리를 전송미디어 내 금액입니다. </li><li> 각 드롭 트롬빈 / CA 2 + 솔루션의 7.5 μL를 추가합니다. 젤 거의 즉시 양식 때문에 혼합이 불필요합니다. </li><li> 두 번째 parafilm 코팅 유리 슬라이드로 젤 커버, 100mm 페트리 접시에 거꾸로 슬라이드를 넣고 5 분 동안 인큐베이터에 전송할 수 있습니다. </li><li> MM을 포함하는 페트리 접시에 비즈를 전송하고, 다음뿐만 아니라 이전에 설명한 문화에. 비즈가 함께 붙어 있으면, 어떤은 비즈 사이의 상호 연결로 인해, 그들은 부드럽게 포셉로 구분하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 뿌리의 이미징 및 미디어 변경 <ol><li> 매 2 일, 교양 모공은 가벼운 현미경과 뿌리 직경이 소프트웨어 프로그램 ImageJ로 측정을 사용하여 몇 군데 있습니다. </li><li> 매 2 일, 성장 미디어 (50 μL)의 절반은 신선한 사전 equilibrated 성장 미디어로 대체됩니다. </li></ol> 5. 3D 매트릭스로부터 체외의 Oocyte의 성숙에 뿌리 복구 (IVM) <ol><li> 문화 8 일 후에, hydrogels 분명 섬유소 구성 요소의 저하를 완료로 인해 나타납니다, 그리고 모공은 300-400 μm의의 직경을 확장합니다. 나머지 알지네이트요은 알지네이트요 - lyase, 특히 알지네이트요를 저하와 동물 세포에 영향을주지 않는 식물 유래 효소에 의해 저하됩니다. </li><li> 구슬이 들어있는 우물에서 성장 미디어를 제거하고 10 IU / αMEM의 ML 알지네이트요의 lyase 100 ML를 추가합니다. 25~30분위한 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요. </li><li> 뭉툭한 끝 끝으로 해산 비즈에서 머리카락을 제거합니다. DM을 포함 IVF 요리의 외륜 먼저 전송하고 잘 센터에도 씻어 DM 포함. </li><li> 세척 후, 바깥쪽으로 모공을 전송하고, 성숙 미디어를 포함하는 IVF 요리의 다음 내부 고리. 체외의 성숙 미디어에서 (IVM) αMEM 10 % FCS, hCG 1.5 IU / ML로 구성되어 있으며, 5 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF)의 </li><li> 15~16시간에 대한 CO 2 배양기로 전송합니다. 큐뮬러스 세포 확장을위한 모공 검사합니다. , oocyte에서 적운 세포를 제거 최종 농도 hyaluronidase 솔루션을 추가 0.1 MG / ML 후 2-3 분 동안 인큐베이터에서 부화시오. 몇 시간을 아래와 pipetting하여 oocyte에서 전단 큐뮬러스 세포에 75mm의 micropipette 팁을 사용합니다. 가벼운 또는 해부 현미경 oocyte의 성숙 단계를 확인합니다. 가능한 단계는, 적어도 대부분의 성숙으로, 다음과 같습니다 <ul><li> 퇴화한. oocyte는 두 개 이상의 조각으로 조각화되어 있습니다. </li><li> 새싹 소포 (GV) 단계. oocyte는 oocyte (GV)의 핵의 지속적인 존재가 분명 hCG 노출에 대한 응답으로 감수 분열이 재개되지 않았다. </li><li> 새싹 소포 분석 (GVBD). 핵 막에는 oocyte 결석은 아니지만 북극 ​​바디 선물이 없습니다. 따라서 oocyte는 감수 분열 - 난 아직이다. </li><li> Metaphase - II 체포 oocyte (미이). oocyte는 감수 분열을 재개하고, 지금은 metaphase - II에 체포됩니다. 극지 몸은 가벼운 또는 해부 현미경에서 볼 수 있습니다. 나중에 실험에서 수정된 않는 oocyte는 미이에서 유지됩니다. </li></ul></li></ol> 6. 대표 결과 : 우리는 (그림 1) 체외 문화에 대한 FA - IPN의 난소 모공의 소설 캡슐 방법을 설명했다. 난소의 모공은 체세포의 여러 레이어로 둘러싸인 oocyte로 이루어져 있습니다. 여러 세포 구획 간의 통신은 건강한 뿌리 개발 및 oocyte의 성숙을 위해 필수적입니다. 뿌리 9,11,12의 구조를 유지하면서 3D 히드로겔에서 뿌리의 캡슐은 대과 확장을 지원합니다. 모공이 개발로 그들의 볼륨이 기하 급수적으로 확장되고 캡슐 biomaterial은 억제 압축력의 발전없이 확장을 허용한다. FA - IPN은 섬유소는 뿌리에 의해 활성화되고 알지네이트요는 (그림 2) 13 생물 학적 불활성이다 plasmin에 의해 분해됩니다 proteolytically이 천연 소재의 내장 네트워크입니다. 뿌리 성장하는 동안, 섬유소 저하는 뿌리 근처에 로컬 시작, 그리고 섬유소가 히드로겔에서 해결이 될 때까지 계속됩니다. 문화 시대에 걸쳐 그대로 남아 아닌 분해 알지네이트요 구성 요소, 히드로겔의 3D 구조를 지원합니다. 모공은 개발의 보조 무대 (150-180 μm의 직경)에 고립과 FA - IPN의 젤의 개발의 antral 단계에서 400 μm의 확대했다. hCG 자극과 함께, 교양 모공이 큐뮬러스 셀 확장을 받아야 수 있으며, oocytes는 수정을 위해 metaphase II에 감수 분열과 발전을 재개할 수 있습니다. 이러한 결과는 캡슐화 방법 및 캡슐 소재가 체외 (그림 3)의 뿌리 문화와 성공적인 성숙을 허용하는 것이 좋습니다. encapsul 주위 섬유소 저하ated 모공은 문화의 첫날에 시작 일 6 완료됩니다. Aprotinin, 가용성 plasmin 억제제는 섬유소 저하를 변경하고 캡슐 소재 (그림 4)에서 기계 그라디언트를 확장하는 데 사용할 수 있습니다. 모공이 0.01 TIU / ML aprotinin과 교양 경우, 섬유소는 첫 번째 4 일간 저하 느립니다. 그럼에도 불구하고, 모공은 여전히​​ antral 단계 개발하고 oocytes는 aprotinin이 aprotinin의 removed.A 높은 농도 (0.1 TIU / ML) 후 metaphase II에 감수 분열을 재개하는 능력이 남아 크게 섬유소 저하를 억제, 매트릭스 강성은​​ 대과 확장 및 체세포를 방지 매트릭스에 침공을 준수합니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 대과 개발의 흐름도. 난소 대과는 oocyte 개발을 지원 체세포 하나 이상의 레이어로 둘러싸인 중앙에 위치한 oocyte로 구성되어 있습니다. 모공이 preovulatory antral 무대 차에서 개발할 때, oocyte를 둘러싼 체세포는 때 체세포가 인접, 분아 따위에 의해 번식과 차별, 그리고 oocyte의 크기가 증가합니다. 체외의 성숙에 (IVM) 뿌리 문화의 최종 단계입니다 oocyte는 적운 세포를 칭했다, hCG 자극 후 확장하고 oocyte는 감수 분열을 다시 시작하고 metaphase II (미이) 단계로 진행. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="그림 2A" /> 그림 2A. 체외에서 3D 뿌리 문화에 대한 알긴산과 섬유소 - 알지네이트요가. () 알긴산은 부드러운 겔화 및 메쉬의 크기, 제어 강성 및 생물 학적 자동 력이 없음으로 생화학 특성으로 인해 체외의 뿌리 문화에 적합한 자연 biomaterial입니다. 알긴산은 α​​ - L - guluronic 수 소산​​ (G)와 β - D - mannuronic 수 소산​​ (M)의 선형 다당류의 공중 합체입니다. 반복 G의 단량체와 영역, &quot;G - 블록&quot;칭했다, 이가의 칼슘 이온의 존재에 히드로겔를 형성하기 위해 상호 연결되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="그림 2B" /> 그림 2B. (BI)는 작은 캡슐 모공은 문화의 시작 알지네이트요의 낮은 압축력 경험을 할 수 있습니다. 그러나 뿌리는 비드의 갑작스런 볼륨을 확장으로 대과 확장의 반대 방향 (B - II)에 큰 압축력 결과 이​​는 증가하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="그림 2C" /> 그림 2C. 각각의 고분자 사슬 전에 상호 링크로 섬유소 - 알지네이트요 솔루션 완전히 얽혀 버린 있습니다. FA - IPN의 두 구성 요소는 그들이 트롬빈과 칼슘의 혼합물에 노출 있으므로 즉시 상호 링크를 시작합니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="그림 3A" /> 그림 3A. FA - IPN. 중고등 머리카락의 뿌리 절연 및 캡슐에 대한 흐름도는 16 일 옛 마우스 (AI)에서 격리됩니다. 생식기는 (A - II)를 해부하고 있으며, 절연 모공은 유지 보수 매체 (A - 3)와 함께 접시에 전송됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="그림 3B" /> 그림 3B 피브리노겐 알지네이트요 솔루션 뿌리의 캡슐에 대한 드롭 방식 (B : I - IV).. 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션의 두 방울, rinsing 드롭 (10 μL)와 캡슐 드롭 (90 μL)이 요리 (BI)에 pipetted 수 있습니다. 앞으로 3-5 모공은 rinsing 드롭 (B - II)으로 전송됩니다. rinsing 및 미디어 제거 후 모공이 캡슐 드롭 (B - 3)으로 전송됩니다. 각각의 뿌리는 10 μL 피펫 팁 5 μL 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션 aspirated 후 트롬빈 / 칼슘 솔루션 (B - IV)에 퇴학입니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="그림 3C" /> 그림 3C. 5 분 구슬 crosslinks. 피브리노겐 알지네이트요 솔루션 뿌리의 캡슐에 대한 parafilm 방법 (C : I - III). 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션 (7.5 μL)는 parafilm 코팅 유리 슬라이드에 pipetted이며 (CI, II) rinsing 후 모공은 각 드롭에 개별적으로 전송됩니다. 트롬빈 용액 (7.5 μL)가 각 드롭 (C - 3)에 추가됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="그림 3D - E" /> 그림 3D - E. 방울 두 번째 parafilm 코팅 유리 슬라이드 덮여 있으며 FA - IPN은 5 분 동안 인큐베이터에서 가교입니다. (D) 캡슐 모공은 96 - 웰 플레이트 성장 미디어에 전송됩니다. (E) FA - IPN (흰색 화살표)에 캡슐 대과의 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 성장 folli에 의해 섬유소 저하끌레. 모공은 뿌리 주위 클리어 서클에 의해 입증되는 문화 기간 동안 FA - IPN의 섬유소 구성 요소를 저하. 뿌리의 3D 아키텍처는 남아있는 알지네이트요에 의해 지원됩니다. 하루에 0 (D0) 섬유소는 여전히 그대로이며, 뿌리 주위 매트릭스가 흐린이며 문화의 일일 (D1) 뿌리 주변의 맑은 반지가 나타납니다 (흰색 화살표)과 섬유소 저하 프런트는 반경 하루에 확장을 계속하고 후 2 (D2)와 문화의 일 4 (D4). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 뿌리 성장의 이미지. 일 0에 FA - IPN의 대표 이미지 ofsecondary 뿌리의 성장 (A), 4 (B), 6 (C) 문화 8 (D). 팔일 후에 antral 모공은 체외에서 성숙되었고, 결과 미이 스테이지 oocytes는 (E, 북극 시체가 검정색 화살표로 표시됩니다) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. 섬유소 저하는 aprotinin에 의해 저해되었다. 일 2, 4, 10, 12 모공 성장은 첫 번째 행에 표시됩니다. Aprotinin 농도에서 0.01는 TIU / ML (두 번째 행)와 0.1 TIU / ML은 일 0, 2, 4 문화 미디어에 추가되었습니다. 단 aprotinin 제거 후 0.01 TIU / ML aprotinin 저하 섬유소와 문화를 뿌리 및 antral 단계에 도달했습니다. 0.1에서 교양 모공이 TIU / ML aprotinin은 FA - IPN에서 성장하지 않았다. <table border="1"><tbody><tr><td> 약어 </td><td> 전체 이름 </td></tr><tr><td> CO 2 인큐베이터 </td><td> 37 5% CO 2 ° C 배양기 </td></tr><tr><td> COC </td><td> 큐뮬러스 oocyte 복합 </td></tr><tr><td> 3D </td><td> 차원 3 </td></tr><tr><td> DM </td><td> 해부 미디어 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 표피 성장 인자 </td></tr><tr><td> FA - IPN </td><td> 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 태아 소 혈청 </td></tr><tr><td> GM </td><td> 성장 미디어 </td></tr><tr><td> GV </td><td> 새싹 소포 </td></tr><tr><td> hCG </td><td> 인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 </td></tr><tr><td> ITS </td><td> 인슐린 트랜스페린 셀레늄 보충 </td></tr><tr><td> IVF 요리 </td><td> 잘 센터 체외 수정을 접시에 60mm </td></tr><tr><td> MM </td><td> 유지 보수 매체 </td></tr><tr><td> 미이 스테이지 oocyte </td><td> Metaphase II 스테이지 oocyte </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> 재조합 Follicular 자극 호르몬 </td></tr><tr><td> TBS </td><td> 트리스는 호수 버퍼 </td></tr><tr><td> TIU </td><td> 트립신 억제 단위 </td></tr></tbody></table> 표 1. 약어

<ol>
	<li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+maturation,+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system.">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li><li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture.">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li><li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles.">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li><li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture,+in+vitro+follicle+development+and+transplantation:+implications+for+fertility+preservation.">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li><li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development.">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li><li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development.">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li><li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose.">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li><li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes.">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles.">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li><li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+follicle+micro+environment.">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility.">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

FA - IPN의 표시 난소 대과의 캡슐 방법은 체외에서 3D 환경에서 뿌리 문화를 수 있습니다. FA - IPN은 초기 기계적 특성이 섬유소와 알지네이트요 모두의 조합에 의해 결정하는 동적 셀 응답 매트릭스입니다. 문화 동안 캡슐 대과은 전적으로 문화의 끝에 남은 알지네이트요에 의해 공헌하는 점차 감소 젤 강성 결과 IPN의 한 구성 요소, 섬유소를 저하 프로 테아제을 활성화한다. FA - IPN로 얻은 동...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fetuin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>F3385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Gibco</td>
<td>10082-139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aprotinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10236624001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wako</td>
<td>039-00475</td>
<td>40 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A412</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>rFSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1884-1VL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;MEM+Gluta MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>32561</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-002-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tisseel Fibrin kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>921030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Alginate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FMC BioPolymers</td>
<td>LF200DL</td>
<td>Mw 418kDa</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3 dimensional system

난소 대과는 섹스 호르몬을 secretes 난소의 기능 단위이며, oocyte의 성숙을 지원합니다. 체외의 대과 기술의 기본적인 생물을 조사하기 위해 모델 대과 개발하는 도구를 제공하고, 추가로 다산을 보존하는 기술로 발전되고있다 클리닉 1-4. 우리의 체외 배양 시스템은, 세포 세포의 상호 작용 및 paracrine 신호 것을 직접 고치 개발 5 3D follicular 구조를 유지하여 기본 난소 환경을 모방하기 위해 hydrogels을 사용합니다. 이전 모공이 성공적으로 알지네이트요, 칼슘 이온 6-8로 겔화를 겪습 불활성 조류 파생 다당류에 교양되었습니다. 0.25 % W / V의 농도에서 형성된 알긴산의 hydrogels는 뿌리 문화에 가장 허용되었고, 최고의 개발 역량 9 유지. 알긴산의 hydrogels 따라서, 뿌리의 성장 10 영향을 줄 수 있습니다 뿌리 압축력에 뿌리 직경 결과에 증가 분해되지 않습니다. 우리는 이후 섬유소와 알지네이트요의 혼합물을 동시에 gelled있는 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크 (FA - IPN)을 기반으로하는 문화 시스템을 개발했습니다. 두 구성 요소가 처음 매트릭스 강성에 기여하기 때문에이 조합은 역동적인 기계 환경을 제공하지만, 성장 뿌리에 의해 분비 프로 테아제 지원을 제공하기 위해서만 알지네이트요를 떠나 매트릭스의 섬유소를 저하. IPN으로 알지네이트요 내용은 혼자 5 알지네이트요 가능하지 않습니다 0.25 %, 아래 줄일 수있다. 따라서 뿌리가 확장되면, 그것은 감​​소 고체 내용으로 인해 감소 압축 힘을 경험하게 될 것입니다. 여기에, 우리는 캡슐화 방법 및 FA - IPN 이내에 난소의 모공에 대한의 체외 배양 시스템을 설명합니다. 동적 기계적 환경은 작은 모공이 단단한 피질에 거주하고 크기가 11 증가로 더 허용 모수로 이동하는 자연 난소 환경을 모방한 것이었 지요. 분해 구성 요소는 인간의 머리카락은 정상적으로 생체내에서 받아야 해당 볼륨에있는보다 큰 10 6 배 증가를 지원하기 위해 임상 번역에 특히 중요있을 수 있습니다.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.2K 조회수.  Northwestern University. 3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

연구

생체공학

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

다 잘 판에 대 한 시스템을 삽입 하는 결단 력과 침투성 막에 3 차원 조직 모델에서 보급의 시뮬레이션 하는 방법

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...