비타민 C는 과일과 채소의 영양가를 나타내는 지표입니다. 우리는 특히 전 세계적으로 가장 많이 소비되는 잎채소인 양상추에서 이를 정량화하기 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법이 필요합니다. 이 방법은 비타민 C 분해를 방지하고, 향상된 추출과 아스코르빅과 탈수성 코르브산 모두의 빠르고 신뢰할 수 있는 정량화를 제공합니다.
이 방법은 식품 기술에서 영양 사실 라벨을 만드는 데 사용할 수 있으며, 의학에서 건강과 식물 사육에 대한 식품 효과를 연구하여 다른 종의 비타민 C 함량을 증가시킬 수 있습니다. 이네스 메디나 로자노와 함께 절차를 시연하는 것은 호세 엔젤 아란주엘로와 아란타자 카스텔라노스, 내 실험실에서 두 분석가가 될 것입니다. 식물 샘플을 준비하려면 식물 당 적어도 하나의 외부 잎과 하나의 내부 잎을 수확하고 즉시 액체 질소에 잎을 동결한 후 영하 80도 저장에 놓습니다.
냉동 식물 샘플을 lyophilize하려면, 리오필라이저의 동결 건조기 챔버 내의 트레이에 미제한 샘플 튜브를 배치하고, 표시된 대로 리오필라이저를 프로그래밍한다. 연축기 온도를 영하 80.2도에서 유지하며, 진공상수는 112에서 112에서 재료가 완전히 건조할 때, 20밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 10mm 직경의 스테인레스 스틸 볼을 라이오필화 시료에 추가한다. 그리고 적절한 시간과 강도에 멀티 튜브 소용돌이를 사용하여 샘플을 미세 먼지로 갈아 냅니다.
아스코르브 산 표준 스톡 및 희석 용액을 준비하려면 정밀 균형에 정확히 10 밀리그램의 아스코르브 산 표준의 무게를 측정합니다. 그리고 90 밀리리터의 이동단계에서 시료에 이르기까지. 마그네틱 교반기를 사용하여 시료를 용해시키고 체피 플라스크를 사용하여 결과 용액의 100 밀리리터를 정확하게 측정합니다.
필요에 따라 포믹산으로 pH 2에서 산성화된 초순수를 추가합니다. 그런 다음 스톡에서 5개의 희석제를 준비하여 교정 곡선을 얻습니다. 저조도 하에서 작동, 15 밀리리터 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브에 50 밀리그램의 lyophilized 접지 샘플과 5 밀리리터의 추출 용매를 추가하고 5 초 동안 용액을 소용돌이.
분당 2000 회전에서 궤도 셰이커에서 10 분 동안 샘플을 흔들어 실온에서 10 분 동안 초음파 욕조로 튜브를 옮기고 원심분리로 샘플을 수집합니다. 그런 다음 0.22 미크론 재생 셀룰로오스 필터를 통해 상체균제를 5 밀리리터 앰버 바이알로 변형하여 추출물 에서 아스코르빅 및 탈수액코르빅 산을 모두 추출합니다. 잎 샘플에서 아스코르브 산 농도를 결정하기 위한 희석을 준비하려면 2밀리리터 앰버 액상 크로마토그래피 바이알에 200 마이크로리터와 800 마이크로리터의 초순수물을 추가하고 PTFE/실리콘 플러그로 바이알을 닫습니다.
총 아스코르브 산 추출의 경우, 추출물 200 마이크로리터를 2밀리리터 앰버 액상 크로마토그래피 바이알로 옮기고, 200마이크로리터를 바이알에 환원한다. 플러그로 바이알을 닫고 5초 동안 용액을 소용돌이시다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 30분 동안 배양한 후, 0.4 몰라 황산200마이크로리터를 사용하여 반응을 멈추고 아스코르브산을 산성 pH로 안정화시하십시오.
샘플에서 총 아스코르브 산 농도를 결정하기 위한 희석을 준비하려면 400마이크로리터의 초순수를 추가하여 총 아스코르브산 추출물 2개에 첨가한다. 플러그로 바이알을 닫습니다. 실험을 시작하기 최소 한 시간 전에 모든 작업 솔루션이 UPLC 시스템에 로드되었는지 확인하고 세 개의 UPLC 모듈을 켭니다.
내부 교정 프로세스가 완료되면 소프트웨어를 열고 기악 프로그램을 로드합니다. 소프트웨어가 로드되면 쿼터터얼 솔벤트 관리자를 클릭하고 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하여 시작 콘솔을 선택하여 UPLC 관리 콘솔에 액세스합니다. 시스템, 제어 및 시동을 클릭하여 UPLC 기기의 준비 및 안정화를 진행하고 프라임 솔벤트, QSM, 체크 인감 세척 및 프라임 기간을 5분 이상 확인하여 UPLC 라인을 5분 이상 제거합니다.
SM을 클릭하고 45초 이상 세척 용매를 확인합니다. 퍼지 용매를 확인하고 35 사이클을 사용하여 인젝터를 제거하고 청소하십시오. UPLC를 메서드 조건에 대고 상량화하려면 방법 및 QSM에 평형화하고 흐름을 분당 0.3 밀리리터로 설정합니다.
용매 A 내지 2%용매 B 내지 2%~0%용매 C 98%, 용매 D내지 0%는 여전히 방법 및 SM에 평형화되고 샘플을 섭씨 5도, 컬럼을 섭씨 30도로 설정한다. 메서드 및 기타와 평형상태로 램프 를 선택하고 시작을 클릭합니다. 장비가 적어도 한 시간 동안 안정화되도록 합니다.
안정성을 확인하려면 콘솔 시스템 및 QSM 시작을 클릭하고 QSM 시스템 압력을 선택하여 열의 압력을 확인합니다. 압력 변화에 식별 가능한 추세가 없고 델타 값이 평방 인치 당 10 파운드 미만인 경우 빠른 시작 화면에서 분석할 표준 및 샘플의 이름으로 행렬을 채웁니다. 표준에서 아스코르브 산 농도를 결정하기 위해 UPLC 기기에 각 희석제 의 5 마이크로리터를 주입하고, 대부분의 희석에서 시작하여 표에 표시된 가장 농축 된 용액에 크로마토그래피를 수행합니다.
잎 샘플에서 아스코르브산 과 총 아스코르브산 농도를 결정하기 위해, 희석된 추출물 의 5마이크로리터를 각각 1개 주입하고 각각 2개 추출하여 크로마토그래피 분석을 위한 UPLC 기기에 넣습니다. 아스코르브산 및 총 아스코르브산 농도를 계산하려면, 소프트웨어에서 퀵스타트, 검색 프로젝트, 채널, 표준 또는 샘플 및 PDA 채널 1, 245 나노미터 에서 1.2 나노미터를 클릭한다. 표준 및 샘플 크로마토그램을 열려면 크로마토그램의 시작점을 클릭하고 끝점으로 드래그하여 표준 및 샘플에 해당 피크를 통합합니다.
그런 다음 아스코르브산 표준 희석제로부터의 데이터를 사용하여 교정 곡선을 구축하고, 크로마토그래피결정 된 흡광도 값을 나타내고 시료의 흡광도 값을 보간하고, 아스코브산 및 총 아스코르브산 농도를 얻을 수 있다. Lactuca 행렬의 비타민 C 정량화는 신뢰할 수 있는 결과를 보장할 수 있는 크로마토그래피 접근법의 개발이 필요합니다. 여기서, 미커 숄더에서 확인되지 않은 것과 함께, 비최적화 프로토콜 발표 및 아스코르브 산 피크에서 유래한 크로마토그램을 관찰할 수 있다.
그럼에도 불구하고 추출 및 크로마토그래피 조건을 개선한 후 알 수 없는 화합물의 간섭 없이 해결된 아스코르브 산 피크를 달성할 수 있다. 또한, HPLC 자외선 대신 UPLC 자외선 장비의 사용은 유지 시간 및 실행 시간을 줄입니다. 아스코르브 산 피크의 간섭은 크로마토그래피 과정에서 분리가 부족하여 비타민 C 함량을 과소 평가합니다.
겹치는 피크 영역이 둘 사이의 가장 깊은 지점에서 수직 낙하에 의해 통합됩니다. 또한 최적화되지 않은 프로토콜을 사용하면 결과에서 유용한 결론을 추출할 수 없습니다. 모든 샘플은 유사한 비타민 C 함량을 가지고 있는 것처럼 보이자, 그 형태중 어느 형태로든.
대조적으로, 최적화된 프로토콜을 사용하면 다양한 유형의 샘플 간에 통계적으로 유의한 차이를 감지할 수 있습니다. 여러 샘플을 수집, 샘플을 올바르게 보존하고, 산화 제에 대한 샘플의 노출을 최소화하고 비타민 C의 두 형태를 정량화하기 위해.
