Name: a straightforward method for glucosinolate extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography (hplc)
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC at JoVE.com

NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University T&#252;bingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).

글루코 추출에 필요한 솔루션 1. 준비 <ol><li> 유리 병에 물을 70 % 메탄올 (MeOH 중) 500 ㎖ (초순수)를 준비한다. 100 샘플 5 기준 70 %의 420 mL의 메탄올의 경우에는 필요하다. </li><li> 의 NaOAc 0.82 g의 NaOAc 또는 X 3 H 1.36 g을 첨가하여 20 MM의 아세트산 나트륨 (NaOAc) (의 pH = 5.5)을 제조 2 O 물 500ml에; 염화수소로 pH를 조정한다. 냉장고에의 NaOAc를 저장합니다. 100 샘플 5 표준 물에 20 mM의 아세트산 나트륨 (NaOAc) (PH = 5.5) 370 mL를가 필요하다. </li><li> 열 물질을 제조 초순수 125 mL를 가교 덱스 트란 겔 (타입 G-25) 10g을 혼합한다. 냉장고 (4 ℃로)에서 생성 된 혼합물을 저장합니다. </li><li> sulfatase 용액의 조제 <ol><li> 초순수의 30 mL에 아릴 sulfatase의 10,000 단위 (유형 H-1 헬릭스 pomatia에서)를 용해시키고, 무수 에탄올 30 ㎖ (의 EtOH)를 추가합니다. 잘 솔루션을 혼합 한 250 ML의 CEN로 전송trifuge 관이나 가용성에 따라 여러 개의 작은 튜브,. </li><li> 실온에서 20 분 (RT)에 대해 2,650 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 비커에 뜨는 (들)을 전송; 의 EtOH 90 mL를 넣고 그것을 섞는다. RT에서 15 분 동안 1030 × g으로 하나 이상의 원심 분리기 튜브에서 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 용해 초순수 25 ㎖의 총 펠렛을 결합한다. 소용돌이는 물론, -20 ° C에서 냉동실에 1 mL의 튜브에 분배, 저장; 그들은 1 년 이상 유지합니다. </li></ol></li><li> sinigrin 기준 용액의 제조 <ol><li> 1 μg의 정확도 (예를 들면, 8.769 mg)을 함께 sinigrin 수화물 9 mg의 주위에 무게. 10 mL의 용량 플라스크로 이동 및 초순수의 10.0 mL의에 sinigrin 수화물을 용해. </li><li> 스톡 용액의 몰 농도를 계산하고 원액 희석 50-750 μM 5 ~ sinigrin 참조를 준비한다. 자세한 예를 들어, 참조<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">보충 파일 S1</a> . </li><li> 1.5 mL를 반응 튜브 내의 다른 sinigrin 참조를 분주하고 20 ℃에서이를 동결. 각 추출 배치에 다섯 sinigrin 참조의 시리즈를 포함합니다. 농도를 계산할 때 항상 현재 참조 sinigrin 사용에 대한 올바른 몰 농도 값을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 추출 설치 2. 준비 <ol><li> 파스퇴르 피펫 열에 대한 열 랙을 준비합니다 (열 준비 단계 3.1 참조). 샘플 번호를 추적 할 랙 또는 열의 라벨 (도 1 참조). </li><li> 라벨을 2ml의 마이크로 원심 튜브의 같은 번호를 가진 블록을 준비한다 (단계 3.3 및도 1 참조) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 글루코 추출 랙. 앞면 (왼쪽)과 글루코 추출을위한 자체 제작 열 랙 및 블록의 평면도 (오른쪽). 높이 : 100mm 사이의 거리 (파스퇴르 피펫의 열을 유지하기 위해) 구멍을 이동 : 30mm (x 축)은 15mm (Y 축) ×. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 열 및의 microcentrifuge 튜브 3. 준비 <ol><li> 샘플 당 하나의 열과 다섯 sinigrin 참조 샘플에 대한 다섯 가지 여분의 열을 준비합니다. <ol><li> 각 유리 피펫에서, 유리 섬유 약 1cm × 1 cm의 조각을 놓습니다. 피펫가 좁아 지점으로 유리 섬유를 밀어 나무 또는 유리 스틱을 사용합니다. 유리솜 아웃 실행 컬럼 재료를 방지해야하지만 컬럼 용출 저하하므로, 너무 많이 사용하지 않는다. 장갑 ㅁ 착용유리 양모 작업을 갖추고 있습니다. </li></ol></li><li> 열 선반에 열을 위 (도 1 참조). 연속 열 세척에 사용되는 용리액을 잡으려고 랩 트레이 (폐기물 트레이)의 열 선반을 두십시오. </li><li> 플라스틱를 1ml 피펫 팁 피펫 제조 칼럼 재료 0.5ml의 선단 떨어져 제 5mm 잘라 각 열에 (물 중 G-25 겔을 단계 1.3 참조). 피펫 전에 잘 컬럼 재료를 포함하는 병을 흔들어. 새는 열 (유리 양모 층을 통해 실행 G-25 물질)을 폐기하고 새 것으로 교체합니다. <ol><li> 컬럼에 컬럼 재료 피펫 팅 한 후, 물질을 세척하는 초순수의 1 mL를 넣어. </li></ol></li><li> 샘플 당 2 mL의 반응 튜브와 다섯 sinigrin 참조 샘플에 대한 오 튜브를 준비; 그 레이블을 붙입니다. 이후 동결 건조 용 캡에 구멍을 만들기 위해 해부 바늘을 사용하고 같은 동일한 패턴으로 튜브 블록으로 제조 된 튜브를 배치열 (단계 2.2,도 1 참조). </li></ol> 글루코 4. 추출 <ol><li> (상기 추출물의 최종 글루코 농도가 기준 곡선의 범위 내에 있어야하는 건조 중량의 일반적 50.0-100.0 mg)을 2 ㎖의 가장 가까운 0.1 mg의 표시된 원형 건조 동결 미세 어스 식물 재료 무게 -bottom 반응 튜브. 각 튜브에 지연 제를 끓는으로 두 개의 작은 금속 공 (직경 3mm)를 추가합니다. 주 :이 프로토콜은 또한 액체 질소하에 분쇄 추출 전까지 냉동 보관 된 신선한 플래시 냉동 물질에 적용될 수있다. 재료 (19)에서 물에 의해 희석을 보상하기 위해 85 % 추출액에서 추출 칭량 물질의 양 및 메탄올의 비율을 증가시킨다. </li><li> 간단히 각각의 튜브와 소용돌이에 70 % 메탄올의 피펫 1 mL를. 튜브를 닫고 w 핫로 가능한 한 빨리 그들을 배치하기 전에 안전 캡을 밀봉메탄올 그냥 종기 70 %까지 몇 분 (~ 5 분)에 대한 ater에 목욕 (90-92 °의 C). 주의 :이 단계에서 안전 고글을 착용! </li><li> 15 분 동안 초음파 욕조에 샘플 튜브를 놓습니다. 한편, sulfatase을 가지고 냉동실 중 다섯 sinigrin 참조 샘플 RT에서 그들을 해동. </li><li> 울트라 초음파 후, RT에서 10 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 2700 XG에 시료를 원심 분리 관; 펠렛 각 튜브에 형성한다. 레이블 컬럼에 상층 액을 추가하고 별도의 컬럼에 다섯 참조 샘플을 피펫. <ol><li> 상층 액을 피펫 팅하는 동안, 피펫 식물 재료를 피하기 위해 펠렛을 통해 잘 팁을 유지한다. 건조 된 샘플을 사용하는 경우, 상청액 용적 미만 1.0 mL로되므로주의. </li></ol></li><li> 샘플 튜브에 남아있는 펠렛을 70 % 메탄올 1 mL를 넣고 15 분간 초음파 욕조에 배치하기 전에 튜브를 소용돌이. 단계 4.4에서와 같이 다시 원심 분리 튜브 및 superna 추가각각의 컬럼에 tants; 컬럼 재료의 특성으로 인해 상기 글루코의 음전하 황산기 구체적 컬럼 상에 보유된다. </li><li> 세 순차적 인 단계에서 추출물 열을 씻으십시오. <ol><li> 각 열 위에 70 % 메탄올의 피펫 2 × 1 mL를. 다음 1 mL를 추가하기 전에 건조 실행할 수있는 열 기다립니다; 이 추출물 (예를 들어, 엽록소)에서 더 많은 비극성 화합물을 제거합니다. </li><li> 각 컬럼에 초순수 1 ㎖를 첨가하여 메탄올을 플러시. </li><li> 피펫 2 × 1 mL의 20 mM의의 NaOAc는 sulfatase 반응을위한 최적의 조건을 만들기 위해 각 열에 버퍼. </li></ol></li><li> 폐기물 트레이 밖으로 열이있는 랙을 가지고 조직과 랙의 발을 건조. 튜브 및 레이블 튜브 블록 위에 선반을 두십시오. 각 열 선단이 대응하는 라벨, 2 ㎖의 튜브에 있는지 확인 (도 1 참조). </li><li> sulfatase의 soluti의 20 μL를 추가열을합니다. sulfatase가 열 재료의 표면에 도달했는지 확인하십시오. 의 NaOAc의 피펫 50 μL는 sulfatase를 플러시 각 컬럼에 버퍼. 알루미늄 호일로 열을 덮고 하룻밤 서 보자. 주 : sulfatase의 활동으로 인해 황산기들은 물로 용출 수 있도록 열에서 desulfoglucosinolates를 풀어 제거한다. 자세한 설명은 Crocoll 등을 참조하십시오. 19. </li><li> 다음날, 각 컬럼에 초순수의 2 × 0.75 mL를 피펫 팅하여 desulfoglucosinolates을 용출. 모든 열 건조 실행 한 경우, 열 선반을 들어 올려 반응 튜브에서 제거합니다. <ol><li> 튜브를 (뚜껑에 구멍이 있는지 확인) 모자 및 액체 질소 나 그들을 동결 -80 C의 냉동고 ° 30 분. 동결 건조 모든 물을 제거 (샘플 개수 및 동결 건조기의 능력에 따라) 12 내지 24 시간 동안 샘플. </li></ol></li> &lt;리&gt; 동결 건조 후는, 초순수의 정확한 양 (일반적으로 1.0 ㎖)에 잔류 물을 다시 디졸브. 표시 HPLC 바이알에 샘플과 다섯 sinigrin 참조를 전송합니다. 최대 2 주 동안 냉장고 (4 ℃) 또는 HPLC로 분석하기 전에 냉동실 (-20 ° C) 최대 1 년에 샘플을 보관하십시오. </li><li> 하룻밤 후드 아래 열 건조 유리를하자 건조시를 폐기하십시오. 재사용을 위해 4.5 단계에서 사용되는 샘플 튜브에서 금속 공을 복구하고 폐기물 처리 bin에 튜브를 넣어. </li></ol> 추출 된 샘플 5. HPLC 측정 <ol><li> 아세토 니트릴 - 물 구배를 갖는 역상 C 18 컬럼 (4.6 × 150 mm의 3 μm 인 300 Å)의 글루코 별개 0.75 mL / 분의 흐름 및 40 ℃의 칼럼 온도 (표 1 참조) . 229 nm에서 검출과 정량을 수행합니다. </li><li> 같은 열에 있지만 적응 그라데이션으로 sinigrin 참조를 측정용매 사용을 감소시키는 방법 (표 2 참조). 가장 낮은 농도를 기준으로 시작, 다섯 sinigrin 참조를 주입 시작합니다. 그런 다음 열을 청소하고 피크의 이월을 방지하기 위해 모든 열 번째 샘플 후 메탄올 주입 (공백)를 포함하여 샘플을 주입. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시간 [분] </td><td> 흐름 [mL / 분] </td><td> % 물 </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> (35) </td><td> 0.750 </td><td> (65) </td><td> (35) </td></tr><tr><td> (40) </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td colspan="4"> 칼럼 온도 40 ° C를. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 글루코 분리 및 analysi에 대한 아세토 니트릴 - 물 구배역상 HPLC에 S. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시간 [분] </td><td> 흐름 [mL / 분] </td><td> % 물 </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> (10) </td><td> 0.750 </td><td> 89.3 </td><td> 10.7 </td></tr><tr><td> (11) </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td colspan="4"> 칼럼 온도 40 ° C를. </td></tr></tbody></table> 표 2 : 글루코의 정량에 사용되는 다섯 sinigrin 참조 정량 단축 아세토 니트릴 - 물 구배. 6. 글루코 식별 및 정량 <ol><li> 신분증 <ol><li> 상업적 이익과 샘플의 피크의 UV 스펙트럼 및 유지 시간을 비교수, 순수 글루코 참조. 다양한 글루코 클래스에서 UV 스펙트럼의 예 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 가능하면, 참조 표준 또는 LC-MS 18, 19 일에 알 수없는 글루코을 확인합니다. </li><li> 핵 자기 공명 (NMR), 가능하면 알 수없는 글루코을 확인합니다. </li><li> 그림 2, 표 3, 데이터베이스, 또는 참고 문헌에서 그와 피크의 UV 스펙트럼 및 유지 시간을 비교합니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> 가장 일반적인 글루코 클래스도 2 UV 스펙트럼. 여섯 desulfoglucosinolates (GSL)의 UV 흡수 스펙트럼 (200 ~ 350 나노 미터)의 가장 일반적인 구조를 나타내는 클래스 여기서 설명으로서 추출 시판 기준 화합물로 이루어지는 용액에 기초. 일반적인 이름은이야tructural 이름 (괄호 사이), 및 구조 클래스가 제공됩니다. (A) Sinigrin (2- 프로 페닐 GSL) 알 케닐; (B) glucoerucin (4- methylthiobutyl GSL) thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4- methylsulfinlybutyl GSL), 설피 닐; (D) glucobrassicin (인돌 -3- 일 메틸 GSL) 인돌; (E) gluconasturtiin (2- 페닐 에틸 GSL) 방향족; (F) sinalbin 방향족 (4- 히드 록시 GSL). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="2"><li> 부량 <ol><li> 다섯 sinigrin 참조 및 샘플의 피크 아래의 면적을 통합한다. </li><li> 통합 된 영역에 기초하여 상기 측정 된 다섯 sinigrin 참조의 검량선을 구한다. 회귀 직선의 식을 사용하여 글루코 (수학 식 2 참조)의 보간 된 양을 계산하는 (수학 식 1 참조).</li><li> 다양한 글루코의 농도를 계산하는, EC에서 229 nm에서 검출을위한 반응 인자 (M)에 의해 보간 된 양 (X)을 곱 (1990) 16 부 흐너 (1987) 15, 또는 브라운 등. (1993) 17; 가장 일반적으로 검출 desulphoglucosinolates의 합의 응답 계수는 표 3에 제시되어있다. 참고 : 다릅니다 응답 요소 시스템-이 다른 참조에 의해 주어진 서로 다른 값이 있다는 이유가 될 수있다 (참고 문헌 15 ~ 17 참조). 그럼에도 불구하고, 값은 대부분 아주 가까운 및 구조 클래스와 유사한 범위에 있습니다. 협약에 따라, glucobrassicin 다른 인돌 글루코 (도 2)와 유사한 UV 스펙트럼을 가진 알 인돌 글루코 위해 그것을 얻기 위해 응답 인자로서 0.25를 사용하는 것이 바람직 할 것이라고했지만, 1 미확인 글루코의 응답 인자를 설정할농도의 현실적인 추정치 (표 3). </li><li> 샘플에서 글루코 최종 량 (X의 t)를 계산하기 위해 고려 분석에 사용되는 희석 계수 (D) 및 샘플의 질량 (W)을 가지고 (수학 식 3 참조). <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (삼) Y = 피크 면적 기준 5 점의 회귀 곡선의 기울기 m은 = C = Y 축으로 회귀 직선의 절편 추출물의 글루코의 X = 양 식물 샘플에서 글루코의 X t = 농도 D = 희석 인자 외 흐너 (1987) 또는 갈색의 229 nm에서 검출은 M = 응답 인자. (1993) w = 시료의 질량 추출에 사용 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 설립 널리 사용되는 방법의 가장 큰 장점은 강력한 오히려 간단하고, 샘플 당 상대적으로 저렴한 비용이라고합니다. 추출과 분석에 필요한 설비의 대부분은 표준 실험실에서 사용할 수 있어야하거나 PDA-HPLC를 제외하고 자기 구축 할 수있다. 또 다른 장점은 물에 용해 desulfoglucosinolates이 시원하고 기밀 (HPLC) 유리 병에 보관하면 화학적으로 매우 안정하기 때문에 추출물이 쉽게 다른 곳에서 HPLC 분석에 배송 할 수 있다는 것이다. 훈련 된 데이터를 소프트웨어를 관리 및 분석하기위한 광범위한 체험 전문 필요 LC-MS 플랫폼 대조적으로, HPLC-UV / PDA를 쉽게 짧은 훈련 기간 이후에 수행 될 수있다. 이 절차의 비용을 줄일뿐만 아니라, 학생 포함한 과학자 광범위한,이 방법은 더 접근하게 아닙니다. 일반적으로, 절차는 전술 한 바와 carefu을 따라하는 경우에서야 베드로, 몇 가지 문제가 발생한다. 일반적으로, 글루코 피크가 아주 잘 크로마토 그램에서 분리된다. 이러한 경우가 아니라면 그래디언트 프로그램 용리액 아세토 니트릴의 증가 속도를 감소시킴으로써 적응 될 수있다. 또한, 새로운 사전 열 (200-500 주사) 또는 열 (1,500 -2,000 주사)에 구축하면 문제를 해결할 수 있습니다. 때때로, 배치에서 단일 시료의 크로마토 그램은 매우 작거나없는 피크 표시 될 수 있습니다. 이 sulfatase를 추가 할 때 인해 피펫 오류로 일반적으로 (예를 들어, 열이 생략되었거나 sulfatase가 제대로 열 아래로 세척되지 않았다). 예상과 너무 작은 물질이 추출에 사용 된 것보다 다른 방법으로, 실험 재료의 글루코 농도가 낮은되었을 수 있습니다. 후자의 경우, 주입 부피는 100 μL로 증가 될 수 있거나, 추출물의 정확한 부분 표본 (예를 들어, 800 μL)를 농축 할 수있다. 후자는 동결 건조에 의해 달성 될 수있다물을 작은 부피 (즉, 100 μL)에 잔류 물을 용해시키고, 추출물을 보내고, 같은 기준 곡선을 사용하여 재 주입. 추출물의 원래 농도 계산에서, 번호는 희석 인자에 의해 승산되어야한다. 이 문제가 해결되지 않으면, 재료보다 출발 물질을 사용하여 다시 추출해야합니다. 이 100mg 이상이면, 추출 용매의 부피 및 튜브의 크기는 광 추출 효율을 유지하기 위해 비례 적으로 조정되어야한다. 추가 장점은이 방법이 잘 검증 된 것입니다. 이 절차 및 정확도 여러 실험실에서 확인 된 16하는 유채에서 글루코의 정량화를위한 표준 방법으로 설명되어 있기 때문이다. 또한, 유전 적 배경 생합성 및 글루코의 생물학적 기능이 모드에서, 강렬한 연구 노력 될 수 있습니다다른 사람 4, 6, 12 중에서 엘 식물 종의 애기 장대. 따라서 sinigrin 관련 desulfoglucosinolates의 정확한 정량 많은 응답 요소는 잘 정의되고 15,17 공개. LS-MS 기반 프로토콜이 더 높은 처리량, 더 민감하고, 할 수 있지만 (가칭)에는 표준 18, 19, 20, LC-MS에 대한 보편적 인 응답 요소의 부족이 제한 사용할 수 없습니다하는 글루코를 식별 글루코 농도 (18)의 정확한 정량. 더욱이, 이러한 방법은 통상적으로 신선한 식물 재료의 동결 건조 공정, 및 물의 양을 포함하지 않는 것은 정확한 정량 어렵게 계산에 불명이다. 우리 추출법이 포함하기 때문에 마지막 열 기반정제 및 농축 단계, 또한 이러한 통 (21)과 같은 글루코 저농도로 &quot;더티&quot;샘플들에 적용될 수있다. 일반적으로, 신선 동결 재료를 추출하는 추출을 위해 96 웰 플레이트를 사용하고, sulfatase 단계 (18, 19)를 포함하지 않는 LC-MS 기반 방법에 비해, 제안 된 방법은 상대적으로 많은 시간과 노동 강렬하다. 이 문서에 설명 된 열 랙으로, 한 사람이 하루에 약 100 ~ 150 샘플을 추출 할 수 있습니다. 용출 (다음 날), (밤새) 건조 동결 및 재 용해은 다음 두 가지 일 이내에 일어날 수 있습니다. 자동화 된 HPLC 인젝터, 분사 당 40 ~ 45 분의 실행과 평형 시간, 어떤 예기치 못한 사건으로,이 샘플 세트에 대한 데이터를 수집 3-4 일이 소요될 것입니다. HPLC를 소프트웨어는 자동 정량 sinigrin 곡선, 크로마토 그램 및 체육의 수동 검사를 기반으로 허용하는 경우데이터가 통계 분석을 위해 사용하기 전에 100 샘플 AK 과제는 다시 1 또는 2 시간이 걸릴 수있다. 글루코 표준의 증가 가능성에도 불구하고, 130 개 이상의 후보들의 작은 부분은 현재 상업적으로 구입할 수있다. 그러나 생합성 각 클래스에 대한 몇 가지의 참조와; 화합물을 특정 문헌 데이터베이스에 대한 액세스는 이전 식물 종에서 발견 (예를 들어, 파헤이 (22) 등.); 이러한 eluotropic 일련의 논리와 같은 크로마토 그래피 원리의 기초 지식 (예, 지방족 화합물의 측쇄에 세슘의 숫자를 증가시키기 위해, 3 및도 4); 및 NMR (23)에 대한 LC-MS (19) 또는 격리 된 글루코 단일 샘플의 검증, 하나는 쉽게 이러한 한계를 극복 할 수 있습니다. 글루코위한 대부분의 프로토콜은 내부 기준 곡선을 사용하여 분석(즉, 추출 용매 16, 17, 19 sinigrin의 추출 또는 sinalbin 특정 농도). 원칙적으로, 내부 기준 곡선은 높은 정밀도를 얻을 따라서, 이론적으로 각각의 시료 처리 오류를 정정하는 것이 더 적합하다. 이러한 장점에도 불구하고, 우리는 주로 (예를 들어, 브라 파괴 해 24) 또는 sinalbin (예 Sinapis 알바 25)에 sinigrin 높은 수준을 함유 일부 다른 야생종을 분석 같이 5 점 외부 기준 곡선을 선호 이 글루코 참조하는 응답 요소를 사용할 수 있습니다. 고급 글루코 참조 표준은 일반적으로 매우 비싼 더욱이, 각 샘플의 내부 표준을 첨가하여, 분석의 비용을 증가시킨다. 결론적으로, 시간 - 소모적 인 단계에도 불구하고,이 프로토콜추출 및 식물 샘플에서 글루코을 정량화 할 수있는 간단하고 접근 방법을 제공한다. 그러나, 글루코 수준 자체는 단일 글루코 (11)로부터 발생하는 반응 생성물의 단지 myrosinase와 반응 할 필요성으로 본 전위 생물학적 활성의 표시, 및 변동 것을 고려하는 것이 중요하다. 유효성 검사 분석은 생물학적 관련성을 확인하기 위해 수행해야합니다.

식물 화학 물질 (1)의 20 개 이상의 서로 다른 종류를 생산하는 것으로 추정된다. 이들 화합물의 소수 식물 &#39;차 대사, 연료의 성장과 재생에 중요한 역할을하는 것 같다; 대부분의 이차 대사 산물을 소위. 그들은 꽃가루 매개자를 유치하거나 병원균과 초식 동물 (1)에 대한 공장을 방어하는 역할로 자신의 이름에도 불구하고, 이차 대사 산물은 종종 식물의 생존과 재생을 위해 중요하다. 글루코은 150 년이 공부 한 이차 대사 산물의 매우 다양한 클래스입니다. 현재까지 130 개 이상의 구조적으로 다른 글루코는 3 확인되었습니다. 넓게 글루코들은 합성하는 아미노산에 따라 다른 클래스로 분할 될 수있다. 글루코 인돌, 예를 들면, 아미노산으로부터 합성된다트립토판, 페닐알라닌 반면 방향족 글루코 (4)의 합성을위한 기본 골격을 제공한다. 클래스 내에서, 지방족 글루코의 클래스로서 생합성 경로에 순차 사슬 연장 단계에 의해 초래 또는 측쇄 변형 (예를 들어, 히드 록 실화) -4,5-입니다 구조적 다양성의 높은 수준이있다. 하나 글루코 식물 종은 다른 구조 클래스 6에 속하는 최대 37 다른 글루코를 포함 할 수있다. 식물 종은 전형적인 글루코 프로파일을 가지고 있지만, 글루코의 유형에 대한 종자 간 변화는 자주 개인과 인구 6, 7 사이에서 발견된다. 그대로 글루코은 식물 세포의 액포에 저장되어있는, 지하 또는 지상 장기 7에서 찾을 수있다 &lt;SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8, 9. 전지 파열 (예를 들어, 초식 동물에 의해)시, 글루코이 해제되고 겨자 기름 폭탄 (10)을 설정, 효소 myrosinase와 혼합된다. 인해 myrosinase의 활동 및 글루코, 반응 조건 및 변형 효소의 존재의 구조에 따라 상이 매운 독성 또는 유해 화합물 등 니트릴 (ISO) (11) 티오 시아 네이트와 같이 형성된다. 반응 생성물은 높은 생물학적 활성을 갖고; 예를 들면, 그들은 총합 초식 곤충 기피제 (12)의 역할을한다. 글루코의 유전 및 생합성 경로가 아니라, 주로 때문에 초식 동물과 병원균에 저항, 겨자와 양배추의 맛을 구성 요소와 가치, 그리고 부정적인 (progoitrin) 및 인간의 건강 5에 긍정적 인 (glucoraphanin) 효과에 대한 자신의 중요성, 연구한다 </sup&gt; 13, 14. 때문에 역상 고압 액체 크로마토 그래피, 자외선 (UV) 또는 포토 다이오드 어레이를 구비 (HPLC)에 기초하여 생물학적 활성 화합물을 추출 및 검출 방법과 같은 글루코에서 큰 관심 (PDA) 검출기는 일반적으로 1980 년 15부터 사용되어왔다 . 이 방법을 바탕으로, 유럽 공동체는 종자의 글루코 분석 (브라 시카 napus, 평지, 카놀라 16)에 대한 몇 가지 실험실에서 테스트되고 검증 된 표준 프로토콜을 발표했다. 기타 17 (유채에 존재하지 않는 글루코에 대한 추가 응답 인자를 결정함으로써, 예를 들어)이 메소드에 추가됩니다. 글루코 분석 (18), 액체 크로마토 그래피 질량 분석 (LC-MS) 플랫폼 및 높은 처리량 프로토콜의 증가 함에도 불구 <suP&gt; (19)는, 원래의 HPLC-UV / PDA 방법은 아직 널리 과학자들에 의해 사용된다. 주요 이유는이 방법이 간단하고 비용 효율적인, 그리고 광범위한 화학 분석 기술 인프라없이 실험실에 상대적으로 액세스 할 수 있는지입니다. 이 지역 사회에 봉사하기 위해, 식물 재료에서 글루코의 추출 및 HPLC-PDA와의 desulfo-형태의 분석을 위해 우리는 여기에 세부 프로토콜.

<table><tbody><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM&amp;reg; gradient grade for HPLC grade</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&amp;minus;)-Sinigrin hydrate&lt;br/&gt; from horseradish&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Aryl Sulfatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Glass Wool</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Glass/wooden stick</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>2 mL reaction tubes</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotilabo-lab dishes</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Waste tray</td></tr><tr><td>Rotilabo-sealing clips</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Dryer Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril super gradient grade</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>PH Electrode</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2115</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; column (4.6 x 10 mm, 5 &amp;micro;m, 300 &amp;Aring;)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Column Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; column (4.6 x 150 mm, 3 &amp;micro;m, 300 &amp;Aring;)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>with column oven and UV or PDA detector</td></tr><tr><td>Flask 1,000 mL</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Glucosinolate reference compounds</td><td>Phytoplan</td><td>various</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

a straightforward method for glucosinolate extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography (hplc)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

이 방법은 감지 및 모든 구조 클래스에서 일반적으로 발견 desulfoglucosinolates의 분리 (그림 3) 할 수 있습니다. 해로운 2 hydroxyglucosinolate의 progoitrin은 상대적으로 초기 크로마토 그램에서 제공하고 명확하게 유익한 글루코의 glucoraphanin,이 샘플에서 유일하게 methylsulfinylglucosinolate에서 분리된다. Sinigrin는 gluconapin 및 glucobrassicanapin 증가 사이드 체인 길이 (각각 C3, C4 및 C5)와 알케 글루코의 eluotropic 시리즈를 형성한다. 비슷한 논리 시리즈는 두 methylthioalkenyl의 글루코를 들어, glucoiberverin (C3) 및 glucoerucin (C4) 볼 수 있습니다. 4- 히드 록시 및 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin)이 세 인돌 글루코, glucobrassicin의 봉우리와 그 유도체는 또한 명확하게 구분됩니다. 주의 할 점은 neoglucobrassicin 및 glucoerucin 피크뿐만 아니라 gluconasturtiin 유일한 방향족 gluco이 샘플에서 sinolate 인해 믹스 9 루트 추출물의 첨가에이 브라 시카 추출물에서 특히 높다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> 그림 3 : 글루코 추출물의 크로마토 그램. 결합 브라 시카 파괴 해에서 루트 및 촬영 샘플, B.의 라파 및 B. 올레 라 케아의 분석 결과 HPLC 크로마토 그램의 세부 사항 (32 분). 피크 라벨 체류 시간 및 식별 desulfoglucosinolates 대한 약어 (GSL)을 나타낸다. PRO progoitrin = (2-OH -3- 부 테닐 GSL); 라프 = glucoraphanin (4- methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2- 프로 페닐 GSL) GNA = gluconapin (3- 부 테닐 GSL); (40H) = 4 hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3- 메틸 티오 프로필 GSL); GBN = glucobrassicanapin (4- 펜 테닐 GSL); ERU = glucoerucin (4- methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (인돌 -3- 일 메틸 GSL); NAS = gluconasturtiin (2- 페닐 에틸 GSL); NEO = neoglucobrassicin (1 메탄올 - glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> Rorippa의 austriaca의 뿌리 추출물에서 볼 수 있듯이 일반적으로 모델 식물 애기 장대에서 발견되는 긴 체인 메틸 술의 글루코은 또한, eluotropic 시리즈를 보여줍니다. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), 및 glucoarabin (C9)의 크로마토 그램 (그림 4)에 일정한 간격으로 나타납니다. 함께 피크의 UV 스펙트럼과 같은 논리 eluotropic 시리즈 알 글루코 분류하고, 잠정적으로 식별하기 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> 그림 4 : 크로마토 그램 (프레임 9-30 분)는 Rorippa austriaca 뿌리 추출물의 desulfoglucosinolates의. 피크 라벨 체류 시간 및 식별 desulfoglucosinolates 대한 약어 (GSL)을 나타낸다. HES = glucohesperin (6- methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7 methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (인돌 -3- 일 메틸 GSL); HIR는 glucohirsutin (8 methylsulfinlyoctyl를 GSL) =; ARA = glucoarabin (9 methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1 메탄올 - glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 일반 이름 </td><td> 측쇄 구조 </td><td> 체류 시간 (분) * </td><td> 229 nm의 </td><td> 참고# </td></tr><tr><td> aliphatiC의 글루코 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> 메틸 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Sinigrin </td><td> 2- 프로 페닐 </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> 브라운, EC </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3 테닐 </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4 펜 테닐 </td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3 메틸 티오 </td><td> 10.9 </td><td> 0.8 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4 methylthiobutyl </td><td> 14.0 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3 methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoraphanin </td><td> 4 methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5 methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6 methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7 methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8 methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9 methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3 methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2 (R) -OH -3- 부테 </td><td> 4.5 </td><td> 1.09 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH -5- 펜 테닐 </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> EC </tD&gt; </tr><tr><td> 인돌 글루코 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 hydroxyglucobrassicin </td><td> 4- hydroxyindol -3- 메틸 </td><td> 11.2 </td><td> 0.28 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicin </td><td> 인돌 -3- 일 메틸 </td><td> 15.3 </td><td> 0.29 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> 4 Methoxyglucobrassicin </td><td> 4- methoxyindol -3- 메틸 </td><td> 18.2 </td><td> 0.25 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1- methoxyindol -3- 메틸 </td><td> 22.5 </td><td> 0.2 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> 방향족 글루코 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalbin </td><td> 4- 히드 록시 벤질 </td><td> 8.1 </td><td> 0.5 </td><td> 뷰 흐너 </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH -2- 페닐 에틸 </td><td> 12.1 </td><tD&gt; 0.95 </td><td> 다음 참조 </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH -2- 페닐 에틸 </td><td> 12.7 </td><td> 0.95 </td><td> 뷰 흐너 </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> 벤질 </td><td> 13.8 </td><td> 0.95 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Gluconasturtiin </td><td> 2- 페닐 에틸 </td><td> 18.0 </td><td> 0.95 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> 알 - 지방족 / UV 스펙트럼과 같은 방향족 </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> EC </td></tr><tr><td> 알 - 스펙트럼 등 인돌 </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> EC </td></tr><tr><td colspan="5"> * 대략적인 체류 시간 (RT)은 (열, 용출액의 품질에 따라 0.3 분 ±) 가까운 0.1 분에 둥근. 체류 시간은 C 18 컬럼 (150 X 4.6 mm, 3 마이크로 미터의 입자 크기) 플러스 C (18)가 장착 ThermoFisher / 다이오 넥스 궁극적 인 HPLC 플랫폼에서 결정된다 </s표 1에서와 같은 기울기 프로그램 UB&gt; 프리 컬럼 (10 × 4.6 mm, 5 마이크로 미터의 입자 크기). </td></tr><tr><td colspan="5"> 응답 요인 # 참고 : 유채의 글루코에 흐너, R. (에디션 JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff 출판사, 1987); 브라운, PD, Tokuhisa, JG, REICHELT, M. &amp; Gershenzon, 다른 장기와 애기 장대의 발달 단계 중 글루코 축적 J. 변화. 식물 화학. 62 (3), 471-481, 도이 : 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6 (2003); EC. 오일 씨앗 - 글루코 고성능 액체 크로마토 그래피의 결정. 유럽 ​​공동체의 공식 저널. L의 28분의 170. 부속서 VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> 표 3 :의 응답 요인이 가장 일반적으로 발견 desulfo - 글루코 C (18) 열에 식물 추출물과 대략적인 체류 시간. 용리액, gradien표 1에서 t, 컬럼 온도 및 유속.

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A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

고압 액체 크로마토 그래피와 글루코 추출 및 분석을위한 간단한 방법 (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

25.1K 조회수.  German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig. Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography. 

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Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

연구

환경과학

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

화학

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

스트레스 응답하는 동안 식물 호르몬을 모니터링

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

생물학

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

가압된 열 수 추출 학부 실험실에서 천연물 화학 탐구 (PHWE) 채용

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant physiology. Due to their negative charge, low abundance and susceptibility to hydrolytic activities, the detection and quantification of these molecules is challenging. This is particularly the case for highly phosphorylated forms containing &#8216;high-energy&#8217; diphospho bonds, also termed inositol pyrophosphates (PP-InsPs). Due to its high sensitivity, strong anion exchange high-performance liquid chromatography (SAX-HPLC) of plants labeled with [3H]-myo-inositol is currently the method of choice to analyze these molecules. By using [3H]-myo-inositol to radiolabel plant seedlings, various InsP species including several non-enantiomeric isomers can be detected and discriminated with high sensitivity. Here, the setup of a suitable SAX-HPLC system is described, as well as the complete workflow from plant cultivation, radiolabeling and InsP extraction to the SAX-HPLC run and subsequent data analysis. The protocol presented here allows the discrimination and quantification of various InsP species, including several non-enantiomeric isomers and of the PP-InsPs, InsP7 and InsP8, and can be easily adapted to other plant species. As examples, SAX-HPLC analyses of Arabidopsis thaliana and Lotus japonicus seedlings are performed and complete InsP profiles are presented and discussed. The method described here represents a promising tool to better understand the biological roles of InsPs in plants.

Here we describe strong anion exchange high-performance liquid chromatography of [3H]-myo-inositol-labeled seedlings which is a highly sensitive method to detect and quantify inositol polyphosphates in plants.

SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

생화학

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars with enhanced organoleptic characteristics and thus, to increase consumer acceptance. High-throughput metabolomic platforms have been recently developed to quantify a wide range of metabolites in different plant tissues, including key compounds responsible for fruit taste and aroma quality (volatilomics). A method using headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) is described here for the identification and quantification of VOCs emitted by ripe blackcurrant fruits, a berry highly appreciated for its flavor and health benefits.
Ripe fruits of blackcurrant plants (Ribes nigrum) were harvested and directly frozen in liquid nitrogen. After tissue homogenization to produce a fine powder, samples were thawed and immediately mixed with sodium chloride solution. Following centrifugation, the supernatant was transferred into a headspace glass vial containing sodium chloride. VOCs were then extracted using a solid-phase microextraction (SPME) fiber and a gas chromatograph coupled to an ion trap mass spectrometer. Volatile quantification was performed on the resulting ion chromatograms by integrating peak area, using a specific m/z ion for each VOC. Correct VOC annotation was confirmed by comparing retention times and mass spectra of pure commercial standards run under the same conditions as the samples. More than 60 VOCs were identified in ripe blackcurrant fruits grown in contrasting European locations. Among the identified VOCs, key aroma compounds, such as terpenoids and C6 volatiles, can be used as biomarkers for blackcurrant fruit quality. In addition, advantages and disadvantages of the method are discussed, including prospective improvements. Furthermore, the use of controls for batch correction and minimization of drift intensity have been emphasized.

A headspace solid-phase microextraction-gas-chromatography platform is described here for fast, reliable, and semi-automated volatile identification and quantification in ripe blackcurrant fruits. This technique can be used to increase knowledge about fruit aroma and to select cultivars with enhanced flavor for the purpose of breeding.

헤드스페이스 고체-위상 미세 추출을 사용하여 블랙커런트 과일의 휘발성 화합물 프로파일링

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

13C 6-Glucose Labeling을 사용한 약용 식물의 일차 장기 식별

13C6&#45;Glucose Labeling Associated with LC&#45;MS&#58; Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary metabolite in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Paris saponin (PS) has a variety of pharmacological activities and PPY is in increasing demand. This study established leaf, rhizome, and stem-vascular-bundle 13C6-Glucose feeding and non-feeding four treatments to precisely certify the primary organs involved in Paris saponins VII (PS VII) synthesis. By combining liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), the 13C/12C ratios of leaf, rhizome, stem, and root in different treatments were quickly and accurately calculated, and four types of PS isotopic ion peak(M&#8722;) ratios were found: (M+1) &#8722;/M&#8722;, (M+2) &#8722;/M&#8722;, (M+3) &#8722;/M&#8722; and (M+4) &#8722;/M&#8722;. The results showed that the ratio of 13C/12C in the rhizomes of the stem-vascular-bundle and rhizome feeding treatments was significantly higher than that in the non-feeding treatment. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves increased significantly under leaf and stem-vascular-bundle feeding treatments. Simultaneously, compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves under rhizome treatment showed no significant difference. Furthermore, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the stem, root, and rhizome showed no differences among the four treatments. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of the Paris saponin II (PS II) molecule (M+2) &#8722;/M&#8722; in leaves under leaf feeding treatment showed no significant difference, and the (M+3) &#8722;/M&#8722; ratio of PS II molecules in leaves under leaf feeding treatment were lower. The data confirmed that the primary organ for the synthesizing of PS VII is the leaves. It lays the foundation for future identification of the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants.

저자 집중 조명: 13C6-Glucose Labeling 및 LC-MS를 사용한 식물 주요 장기 프로파일링

The developed method of 13C6-Glucose labeling combined with liquid chromatography high-resolution mass spectrometry is versatile and lays the foundation for future studies on the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants, as well as the comprehensive utilization of these secondary metabolites.

13명LC-MS와 관련된 C6-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary ...

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

고압 액체 크로마토 그래피와 글루코 추출 및 분석을위한 간단한 방법 (HPLC)

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추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

스트레스 응답하는 동안 식물 호르몬을 모니터링

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SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

헤드스페이스 고체-위상 미세 추출을 사용하여 블랙커런트 과일의 휘발성 화합물 프로파일링

¹³명LC-MS와 관련된 C₆-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

¹³명LC-MS와 관련된 C₆-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

¹³명LC-MS와 관련된 C₆-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)