이 모델은 면역-매개 인간 후방 포도막염의 발병기전을 포함하는 세포 메카니즘을 연구하는데 사용될 수 있다. 이 기술의 의미는 새로운 약물 효능을 모니터링하고 화학적 질병 진행에 대한 기계론적 통찰력을 제공하는 인간 포도막염의 중개 연구로 확장됩니다. 이 모델을 사용하는 주요 이점은 질병 유도의 신뢰성과 질병 진행을 모니터링 할 수있는 비 침습적 내시경 기술의 사용입니다.
여기에서는 여러 판독 값을 사용하여 질병을 유도하고 병리를 평가하는 방법을 설명합니다. IRBP 1-20 완전한 프로인트 보조제 또는 CFA를 준비하려면 최소 부피의 100 % DMSO에서 계산 된 양의 펩타이드를 재현 탁하십시오. 분말이 완전히 용해되면 용액을 혼합하기 위해 부드러운 교반을 사용하여 주입할 마우스 수에 따라 PBS의 최종 계산된 부피에 도달할 때까지 소량의 PBS를 튜브에 추가합니다. 완전한 Freund's Adjuvant를 준비한 후, DMSO PBS 펩타이드 용액을 현탁액에 1:1 비율로 적가하면서 점성 및 고르게 분포된 에멀젼을 형성하기 위해 용액을 부드럽고 자주 피펫팅합니다.
용액을 폭기하려면 700 마이크로 리터로 설정된 1000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 두껍고 크림 같은 에멀젼이 얻어 질 때까지 용액을 반복적으로 피펫팅합니다. 펩타이드 현탁액을 주입하기 전에 주사할 각 마우스를 별도의 케이지에 넣고 23게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 1%마우스 혈청이 보충된 100마이크로리터의 RPMI 1640 배지에 1.5마이크로그램의 보르데텔라 백일해 독소를 복강 내 전달합니다. 백일해 독소 용액을 주입 할 때, 마우스는 긁힌 자세로 잡고 피부를 꼬집어 목 뒤쪽에 텐트와 같은 구조를 형성해야합니다.
바늘을 손가락과 엄지 손가락 사이의 공간에 끼우고 200 마이크로 리터의 IRBP 에멀젼을 텐트 피부에 주입하여 주입 후 압력을 유지하고 바늘 머리를 회전시켜 수축 전에 피부를 닫습니다. 임상 질환을 점수화하기 위해, 주사 후 21일째에, 마취된 펩티드가 주입된 마우스에서 꽃잎 반사에 대한 반응의 부족을 확인하고 동물을 긁어 모으는 동물을 제지하였다. 주사 직후 각 눈의 각막에 1 % 트로피 아미드와 2 % 페닐에 프린을 국소 적으로 적용하십시오.
동공이 완전히 확장되면 마우스를 특수 제작된 현미경 스테이지에 놓습니다. 망막에 완전히 접근할 수 있도록 현미경을 배치합니다. 필요에 따라 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 아이피스를 조정하여 시신경과 망막을 보고 전체 망막 영역의 이미지를 획득하여 주변의 모든 모서리를 조정하고 덮습니다.
혈관 누출을 측정하려면 목 뒤쪽에 100 마이크로 리터의 2 % fluorescein을 피하 투여하고 망막이 라이브 이미지의 중앙에 오도록 마우스를 재배치하십시오. 안저경을 465 내지 490나노미터의 청색광 여기 필터로 설정한 후 형광 주입 후 1.5분 및 7분에 각각의 이미지를 획득한다. 모든 이미지가 획득되면 회복을 위해 항진정제 주사제를 복강 주사하고 마우스가 의식을 회복 할 때까지 모니터링하면서 젖은 담근 식단에 접근 할 수있는 예열 된 매트의 케이지에 마우스를 놓습니다.
영상의 임상 질환 스코어링을 위해, 시신경 디스크 염증, 망막 혈관 커프, 망막 조직 침윤 및 구조적 손상의 중증도에 대한 임상 평가를 기초로 한다. 이러한 각 매개 변수에 1에서 5까지의 척도로 점수를 매깁니다. 총계 총계는 눈 전체에 대한 임상 질환을 대표하며 눈당 최대 20점을 얻을 수 있습니다.
연구의 최종 임상 종점에 대한 안저 영상화 후, 마우스를 안락사시킨다. 조직학적 분석을 위해 눈 전체에 접근할 수 있도록 눈꺼풀을 분리한 다음 구부린 집게를 지구 뒤에 배치하여 안와 결합 조직과 시신경을 잡고 눈을 핵을 제거합니다. 핵이 제거 된 눈을 최소 15 분 동안 4 % 글루 타르 알데히드 1-5 밀리리터에 넣고 최소 24 시간 동안 장기를 1-5 밀리리터의 10 % 포름 알데히드로 옮깁니다.
조직학적 조직 염색 후, 표준 프로토콜에 따라, 면역 세포 침윤 수준 및 망막 손상 정도에 기초하여 0 내지 3의 척도로 점수를 할당하였다. 안저경 변화는 질병 진행 중 침윤 면역 세포 및 구조적 손상에 따른 조직학적 변화 외에도 망막 조직, 혈관 및 시신경 디스크 염증 및 망막 구조적 손상을 포함하는 염증 변화로 분류됩니다. 이러한 임상 및 조직 병리학 적 변화는 질병 진행을 평가하고 치료 적 개입 효능을 평가하기 위해 등급화되고 채점 될 수 있습니다.
혈관 누출은 또한 모델과 인간 포도막염의 병리학 적 특징입니다. 이 분석에서 예시된 바와 같이, 플루오레세인은 이 모델의 또 다른 판독값으로 혈관 누출을 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. 연구자는 에멀젼이 용액 사이의 분리 징후 없이 올바르게 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다.
그들은 철저히 혼합되어야하며 최종 제품은 질감이 매끄러 워야합니다. 이 절차는 다른 약물 투여 방법 및 망막 면역 세포 집단에 침윤하는 표현형을위한 세포 분석과 결합 될 수 있습니다.
