LISCA에게 불린 단하나 세포 배열의 살아있는 세포 화상 진찰은 또한 개별적인 세포의 수백의 형광 시간 과정의 자동화된 판독입니다. 접근의 장점은 개별 세포 반응이 동일 마이크로 환경에서 공간적으로 고립된 세포에서 기록되어 훌륭한 통계를 가진 효율적인 방출 분석을 허용한다는 것입니다. 단일 셀 어레이를 제작하려면 메스를 사용하여 PDM 층에서 6 개의 마이크로 파우더 스트라이프가 들어있는 단일 PDM 걸작을 자르고 마이크로 패턴이 위로 향하는 실험실 벤치에 걸작을 배치하십시오.
면도날을 사용하여 6개의 마이크로패턴 줄무늬를 각각 PDM 스탬프로 잘라패턴 영역 중 일부를 잘라 스탬프의 가장자리가 열려 있는지 확인합니다. 다음으로, 6개의 챔버 슬라이드의 커버 슬립의 보호 호일을 조심스럽게 긁어 슬라이드의 채널 위치를 표시하고 보호 호일을 내려다 보고 있는 벤치에 덮개 슬립을 놓습니다. 핀셋을 사용하여 표시된 채널 위치에 스탬프를 부착하고 마이크로 패턴을 아래로 향하고 현미경으로 스탬프부착을 확인하십시오.
슬라이드와 접촉하는 사각형은 인터스페이스보다 더 어둡게 나타납니다. 슬라이드에 제대로 부착되지 않은 사각형에 의해 패턴 품질이 저하됩니다. 스탬프가 단단히 부착된 경우 커버 슬립과 산소 플라즈마가 있는 우표를 0.2밀리바의 압력과 약 40와트의 우표를 3분 동안 치료하여 PDM 우표와 커버 슬립 친성 사이의 표면을 만듭니다.
플라즈마 세척의 끝에서, 커버 슬립을 생물 안전 캐비닛에 넣고 각 스탬프에 페기폴드 폴리 l-lysine 용액 15 마이크로리터를 추가하여 용액이 스탬프의 친수성 패턴으로 흡수되도록 합니다. 20분 후, 초순수 한 밀리리터로 우표를 헹구는 다. 핀셋을 사용하여 슬라이드에서 우표를 제거하고 초순수의 두 번째 밀리리터로 두 번째로 커버 슬립을 헹구십시오.
커버 슬립이 완전히 건조되면 6개의 채널 끈적끈적한 슬라이드를 커버 슬립에 부착하여 마이크로 패턴 영역이 채널의 바닥과 정렬되는 것을 주의하십시오. 또한 각 채널에 PBS 40 마이크로리터와 40마이크로리터의 fibronectin 용액을 추가합니다. 두 개의 솔루션을 혼합하려면 한 저장소에서 40 마이크로리터를 제거하고 동일한 채널의 반대 저장소에 세 번 추가하여 균일한 용액을 생성합니다.
모든 채널이 혼합되면, 세차당 PBS의 120 마이크로 리터와 각 채널을 세 번 세척하기 전에 실온에서 45 분 동안 슬라이드를 배양. PBS를 섭씨 37도로 교환하고, 1개의 저수지에 120 마이크로리터 배지를 추가하여 채널내 세포 성장 배지를 완전히 보충하고 반대 저수지에서 제거한다. 각 채널에 400, 000 셀의 마이크로리터를 관심 정지 및 40 마이크로리터의 셀 성장 배지를 각 채널에 추가하고, 입증된 바와 같이 세포 용액을 배지와 혼합한다.
혼합 후 각 채널에서 40 마이크로리터의 서스펜션을 제거하여 채널만 셀 서스펜션으로 채워지도록 하고 슬라이드를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 1시간 후, 위상 조영 현미경검사법에 의한 세포 접착력을 확인하고, 각 채널에 섭씨 37도의 마이크로리터 120을 추가한 다음, 슬라이드를 세포 배양 인큐베이터로 3시간 더 돌려보세요. 관류 시스템을 설정하려면 37°C의 세포 성장 배지로 채워진 1밀리리터 주사기를 시스템의 입구 튜브에 연결하고 밸브를 사용하여 튜브를 매체로 채웁니다.
입구 튜브를 한 채널의 저장소에 연결하여 기포가 갇히지 않도록 주의하고, 현재 채널의 입구 튜브 맞은편에 있는 저수지에 직렬 커넥터를 연결합니다. 필요한 수의 채널이 연이어 연결될 때까지 설명된 대로 나머지 채널을 연결합니다. 그리고 출구 튜브를 최종 채널의 자유 저수지에 직접 연결합니다.
그런 다음 커넥티드 튜브를 매체로 채우면 관류 시스템이 누출되지 않는지 확인합니다. 세포의 시간 경과 이미징의 경우, 위상 대비 영상과 형광 이미지를 기록하기 위한 타임랩스 프로토콜을 설정하려면 위상 대비 이미징 및 형광 이미징을 위한 광학 구성을 설정합니다. 10배의 목표, 적절한 형광 필터 및 자동화된 초점 보정 시스템을 사용하여 장기적인 측정을 위한 더 나은 화질을 보장합니다.
단계 대비 이미징에 대해 10밀리초 노출 시간을 선택하고 EGFP 형광 강도를 기록하기 위한 750밀리초 노출 시간을 선택합니다. 위치 목록을 통해 연속 루프와 30 시간의 관찰 시간 사이의 10 분 시간 간격으로 시간 일정을 설정합니다. 다음으로, 현미경의 섭씨 37도 가열 챔버의 샘플 홀더에 단일 지하실 인상에 6 개의 채널을 놓고 무대에 관류 시스템 튜브를 테이프.
15 밀리리터 원판 튜브에 콘센트 튜브의 자유 끝을 삽입하여 액체 폐기물을 수집합니다. 그리고 스캐닝 타임랩스 측정을 위한 위치 목록을 설정하고, 위치 목록을 통해 연속 루프 사이의 정의된 시간 간격 내에서 위치 수를 스캔할 수 있다는 점을 주의한다. 그런 다음 시간 경과 측정을 시작합니다.
형광 마커를 가진 세포의 회전을 위해, 현미경 단계가 움직이지 않는 것을 주의해서, 37섭씨 PBS의 1 밀리리터로 튜브 시스템을 플러시하는 주사기를 사용하십시오. 플러싱 후, 300 마이크로리터의 혈청 감소 배지로 시스템을 채우고, 마이크로리터 당 0.5 나노그램의 mRNA의 최종 농도로, 리포플렉스가 1시간 동안 배양할 수 있도록 한다. 인큐베이션의 끝에서, 어떤 unbound mRNA를 제거하기 위해 섭씨 37도의 1 밀리리터로 시스템을 플러시 완전한 세포 성장 매체.
분석이 끝나면 채널 메뉴에 나열된 채널을 보고 시간 프레임을 스크롤하여 미리 선택된 셀과 통합형 형광 신호를 검사합니다. 관심 있는 셀을 클릭하여 형광 시간 과정을 강조하거나 시간 코스를 클릭하여 해당 셀을 찾습니다. 셀을 클릭하는 동안 이동을 눌러 셀을 선택하거나 선택 해제합니다.
실행 가능하지 않거나 접착 지점에 국한되지 않거나 다른 셀에 부착된 셀을 선택 해제하여 추가 분석에서 제외합니다. 모든 셀을 적절히 선택하거나 선택 해제하면 세포 영역 및 통합형 형광에 대한 단일 셀 시간 과정을 적절한 디렉터리에서 저장합니다. 전환 후 번역 개시 시간을 정량화하고, 셀룰러 EGFP 표현의 강도, 3단계 번역 모델을 사용할 수 있다.
EGFP용 모델 솔루션은 그림과 같이 단일 셀 시간 과정에 장착할 수 있습니다. 여기서, 리포플렉스 전멸 세포의 번역 개시 시간 및 발현 속도의 히스토그램이 관찰될 수 있다. 두 매개 변수가 각 세포에 대해 추정되기 때문에, 이러한 파라미터의 상관관계는 산란 된 플롯에서 입증된 바와 같이 분석될 수 있으며 지질 나노 입자로 감염된 세포와 비교할 수 있습니다.
그림과 같이, 지질 나노 입자로 전이된 세포는 lipoplexes로 전과 감염된 세포에 비해 세포 간 가변성이 적습니다. 그리고 인구 평균은 더 빠른 번역 개시뿐만 아니라 더 높은 발현률을 보여줍니다. 우리의 접근 방식은 또한 다른 마이크로 패터닝 방법에 적응할 수 있습니다.
LISCA에 가장 중요한 것은 좋은 세포 감금과 편리한 사용자 감독과 자동화 된 이미지 분석의 조합입니다. 당신이 본 바와 같이, 세포 행동은 이질적이다. 그리고 단세포 타임랩스 영화는 내재된 생화학 네트워크의 편견없는 역학에 대한 액세스를 제공합니다.
예를 들어 녹색 표현식, 세포 멸망 또는 세포 살인 에세이에서.
