저자 DRS 감사하고 싶습니다. 처음 형광 현미경으로 마이크로 훈련을위한 Philina S. 리 앨런 D. 그로스맨. 저자는 또한 DRS 감사합니다. 도움말 및 팁 이미징 용 멜라니 Berkmen와 하지메 고바야시. 이 작품은 문학, 과학 예술 대학에서와 미시간 대학에서 분자 세포 및 발달 생물학의학과에서 자금 업을 시작하여 지원했다.

현미경에 대한 세포의 성장 문화 1. 하루나 이틀 전에 영상에, B. 준비 subtilis는 시각화하려는 translational 융합 단백질을 포함하는 변형. 단계 1A와 1B의 평가판 반올림 성장 상태가 변형 최고의 영상을 제공하는 결정하기 위해 필요합니다. 대부분의 경우, 세포는 지수 성장 단계에서 몇 군데해야합니다. <ol class="ualpha"><li> 일부 B. 들어 subtilis의 변종 (때문에 그 내생 로커스에 관심과 GFP의 유전자 사이의 translational 융합의 통합이 저조한 성장 특히, 종자)를, 이전 이미지로 이틀 동안 초기 성장은 높은 품질의 이미지가 필요합니다. 첫 날, 승리 B. subtilis는 선택적 항생제 (S)와 LB 한천에 몇 군데로 부담하고 30 ° C.에 밤새 품어 두 번째 날, 하나의 식민지와 0.85 %의 식염수 100 μl를 예방하고 30 하룻밤 배양하여 다음 각 희석 100 μL를 도금 LB 한천 플레이트 세 10 배 시리얼 dilutions (선택적 항생제), ° C. 수행 셋째 날, 세포의 빛을 합류 성장과 희석 접시를 선택합니다. 접시에 라이트 합류 성장 가능성 (4 단계 참조) 우수한 이미징 결과를 얻을 수있는 건강, 기하 급수적으로 증가 스타터 inoculum로 성장 매체를 제공합니다. 이 단계는 얼룩 FM4 - 64과 함께 최고 품질의 막 영상에 특히 유용합니다. </li><li> 기타 B. subtilis의 변종은 단순히 살균 막대 사전 이미징에 하루 하나의 식민지에 대한 선택적 LB 한천 배지에 적용하고 30 ° C.에서 밤새 품어 수 있습니다 그 다음날,이 접시에 전지 (4 단계 참조) 이미징을위한 inoculum로 사용하기에 충분합니다. 참고 : B. 위해 subtilis은 액체 매체 야간 문화로 인해 지연 위상 성장 1 장기간의 원인이됩니다 포자 형성 및 쿼럼 응답의 조합에 해당되지 않습니다. </li></ol> 2. 영상, 125 ML 살균 Erlenmeyer 플라스크에 S7 50 1-3 매체의 장소 10 ML의 아침. 3. inoculum를 얻는 최대 단일 콜로니 또는 가벼운 합류 세포와 LB 한천 플레이트에서 S7 50 중간 2 ML에 세포를 Resuspend. 4. 0.1 ~ 0.08 600 NM에서 측정 초기 광학 밀도 (OD 600)와 문화를위한 10 ML S7 50 매체를 포함하는 Erlenmeyer 플라스크 충분한 S7 50 중간 세포 inoculum을 추가합니다. 이 단계에서 적어도 10 배 공기 매체 비율을 가지고하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 125 ML Erlenmeyer 플라스크에 주사 매체의​​ 10-12.5 ML을 사용합니다. 5. 문화 OD 600에게 ~ 0.5-0.8에 도달할 ° C까지 30 각 문화를 성장. 떨고 물 욕조는 150-200에서 분당 회전과 선호하고 있습니다. DNA 손상이나 불일치 유도 요원과 도전 문화는 초기 기하 급수적인 성장 단계에서해야 OD 600 세포 (표 1 참조) 치료를 위해 필요한 성장의 추가 기간 OD 600 목표에 도달할 것으로 예 예를 들어, 2 aminopurine 한 치료 시간 때문에 2 aminopurine 대우 문화, OD 600 ~ 0.3-0.4에서 해당 OD 600에서 치료 / 성장 결과의 한 시간 정도 ~ 0.5-0.8 같은되어야 필요 의하여 세포 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 샘플 준비 1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 교양 세포의 피펫 300 μl. 2. 세포 세포막의 이미지가 원하는 경우, 1 MG / ML 재고 솔루션에서 각 샘플에 얼룩 FM4 - 64 멤브레인 (Invitrogen)를 1:1000 희석를 추가합니다. FM4 - 64의 적정가 원하는 형광 신호를 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 일반적인 적정 범위는 1:100, 1:1000, 그리고 1:10,000이다. 3. 아래에 설명된대로 슬라이드 1X Spizizens 매체에 1퍼센트 아가로 오스와 함께 준비하는 동안 시료가 10 분 또는 상온에서 앉아 ( &quot;슬라이드 준비&quot;의 1 단계 참조) 허용합니다. 4. 세포의 농도가 필요한 경우, 우리는 진공 장치와 필터 0.2 μm의를 사용하여 필터링 세포를 선호합니다. 전지는 부드럽게 PBS 다른 적절한 버퍼 또는 시각화하기 전에 매체와 필터의 표면에서 세탁하실 수 있습니다. 슬라이드 준비 1. 1X Spizizens와 1% 아가로 오스를 준비합니다. 5 0.5 g 아가로 오스와 함께 10X Spizizens 주식의 45 ML ML ddH2O하고, 녹기 전자 레인지를 추가합니다. 뜨거운 용융 아가로 오스는 피펫하기 어려운이며, 아가로 오스는 피펫 팁을 입력하지 않습니다 확정. 아가로 오스는 ° C 피펫 팁을 입력에 대한 내 응고없이 ~ 55-65의 온도로 물을 욕조에 equilibrated되어야합니다<html> 팁. 2. 피펫 팁에 1퍼센트 녹아 아가로 오스와 Spizizens 20 μl을 그립니다. 얕은 아가로 오스 패드를 형성하기 위해 잘 각 슬라이드 (우리는 15 자 슬라이드를 사용하여 표 2 참조)에 아가로 오스 솔루션의 한 방울 (약 1-2 μL)를 피펫. 아가로 오스는 즉시 고체화됩니다. 슬라이드도 세포의 응용 프로그램에 즉시 이전에하셔야합니다. 아가로 오스 패드가 혼자 실온에서 왼쪽으로있다면, 그들은 분 이내 탈수하고 사용할 수 없게 될 수 있습니다. 아가로 오스 패드가 중심하고 각각 기입 잘하지만 coverslip을 방해하지 않도록 최소 높이를해야; 방울이 (거품처럼) 너무 높다거나 예제에서는 잘 경계 너머 펼쳐지면, 간단하게 닦은 Kimwipe로 잘 청소면을 적용 새로운 아가로 오스 패드. 3. 각각의 아가로 오스 패드의 상단에 배포 슬라이드로 전체 300 μl 샘플을 (6 단계 참조) 적용합니다. 세포의이 금액은 슬라이드의 각 우물을 커버하기에 충분해야합니다. 4. 약 10 분 (23 ° C) 실온에서 앉아 세포와 함께 로드된 슬라이드를 허용합니다. 이 단계는 아가로 오스 패드는 이미지에 대한 고정되어 준비되기에 정착하는 세포 수 있습니다. 온도 변화 4 필요한 실험을 수행할 때 전문적인 요구에이 온도 예를 들어, 변경해야 할 수 있습니다. 5. 패드 스스로를 제거하지 않고 각각의 우물에서 초과 매체를 멀리 대기음. 6. 슬라이드 영역에 걸쳐, 부드럽게 확고하게하고 균일하게 눌러하지만, 슬라이드로 coverslip을 적용합니다. 커버 슬립이 슬라이드 반대하고 커버 용지가 슬라이드 위에 제기하지되었는지 확인하십시오. 세포의 시각화 1. 여러 다른 형광 현미경은 잘 작동합니다. 그것은 100X 기름 침지 렌즈를 가지고하는 것이 중요합니다. 시몬스 랩 사용합니다 <ul><li> 1,45 NA TIRFM 100X 오일 침지 목적 렌즈가 장착된 올림푸스 BX61 현미경 </li><li> 하마 마츠 ORCAR이 CCD는 카메라를 냉각 </li><li> 루멘 200 아크 금속 (이전) 광원. </li><li> GFP (FITC), 필터 여기 460-500과 510-560의 배출 감지 </li><li> FM4 - 64 (TRITC), 필터 여기 510-560과 572-648의 배출 감지. </li><li> 이미지 SlideBook 4.2 (그림 1)를 사용하여 캡처한되었습니다 </li></ul> 2. 하얀 빛을 이용하여 초점에 세포를 가져와. 3. 각 형광단에 맞는 필터를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 대표 결과 대표 이미지 (그림 1)과 같습니다. FM4 - 64 얼룩은 4-7 밝고 명확해야하는 동안 GFP foci는 잘 정의되어야한다. GFP 또는 막 이미지는 모든 데이터의 손실없이 제시하는 최고 품질의 이미지를 수 있도록 모든 색상과 유사 색 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : B. 대표 GFP 이미지 FM4 - 64 멤브레인 얼룩이 빨간색으로 표시되는 동안 subtilis translational 융합 단백질을. GFP 단백질은 녹색으로 표시됩니다. 흰색 스케일 바는 3 μm의을 나타냅니다 (A) MutS - GFP [관련 유전자형 : mutS - GFP (SPC), amyE : Pspac mutL (CAT)]. 600 μg / ML 2 aminopurine 1 MM의 IPTG의 존재 인치 FM4 - 64 신호가 더 명확하게 MutS - GFP foci를 표시하기 위해 표시하지 않습니다 (B) MutL - GFP [관련 유전자형 : mutL : mutL - GFP (SPC)].. 2 - aminopurine의 존재에 (C) DnaX - GFP [관련 유전자형 : dnaX : dnaX - GFP (SPC)]. (D) RecA - GFP [관련 유전자형 : recA : recA - GFP (SPC)] 20의 존재에 NG / ML mitomycin C. (E) TagC - GFP [관련 유전자형 : tagC : tagC - GFP (SPC) ] 1 μg / ML mitomycin C. 앞에서 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 트리 트먼트 / 농도 또는 양을 </td><td> 기능 </td><td> 부화의 시간 </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20-150 NG / ML] </td><td> DNA는 에이전트 alkylating </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> 2 aminopu​​rine (2 - AP) [600 μg / ML] </td><td> 불일치 유도 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (HU) </td><td> dNTPs를 depletes </td><td> 삼시간 </td></tr><tr><td> 자외선 (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymine - thymine dimers의와 6-4 photoproducts </td><td> 20초 일반적으로, 소스에 따라 다릅니다 </td></tr><tr><td> 그라 이스 (이온화 방사선) 5-100 쥐 </td><td> 더블 스트랜드 나누기, 단일 스트랜드 휴식 및 기본 피해 사이트 </td><td> 소스에 따라 다릅니다 </td></tr></tbody></table>&quot;DNA의&gt; 표 1. 요약 손상 및 불일치 유도 트리 트먼트 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Multitest 슬라이드 15 - 글쎄요 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 커버 유리 </td><td> 어부 </td><td> 12-544 - B </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 어부 </td><td> BP160 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> 시그마 </td><td> M0503 - 2MG </td><td> mutagen, 마모 장갑 </td></tr><tr><td> 2 Aminopu​​rine </td><td> 시그마 </td><td> A3509 - 250MG </td><td> 장갑 </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> 시그마 </td><td> H8627 - 25G </td><td> 장갑 </td></tr><tr><td> FM4 - 64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> 민감한 빛 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약 및 장비 목록 :

<ol>
	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

시행 착오는 각 변형에 대한 최고 품질의 이미지에 대한 노출 조건을 찾을 필요, 100-2000 MS의 노출은 GFP (FITC)와 FM4 - 64에 적합한 반면 우리는 1 밀리초는 하얀 빛을 이미지에 적합한 것을 발견 (TRITC ) 이미지. 노출 시간은 사용되는 이미징 장비에 따라 달라집니다. 여러 변종이 동일한 슬라이드에있는 경우에는 패드 국경에서 세포의 패드 품질과 확산은 스트레인 차별 복잡있을 수 있기 때문에 우리?...

특정 솔루션 조리법 1 : 10X S7 50 염 0.5 M의 맙스 100 MM의 질산 황산 50 MM 인산 칼륨 일염기의 소독 필터, 사전 스토리지 포장 S7 박 50 미디어 100x 금속 0.2 M MgCl 2 70 MM CaCl 2 5 MM MnCl 2 0.1 MM ZnCl 2 100 μg / ML 티아민 HCL 이 MM HCL 0.5 MM FeCl 3 * 최종 볼륨 DH 2 O * FeCl 3 석출을 방지하기 위해, 마지막으로 추가되어야합니다. 호일에 필터 살균 후, 랩 100x 금속 솔루션입니다. S7 50 미디어 1X S7 50 염 1X 메탈 1 % 포도당 0.1 %의 글루 탐 산염 40 μg / ML 트립토판 40 μg / ML 페닐알라닌 최종 볼륨에 소주 H 2 O 10X Spizizens (g / L) 151.4 MM의 질산 황산 (20g / L) 803.8 MM 인산 칼륨 일염기의 (140g / L) 440.9 MM 인산 칼륨 이염 (60g / L) 34.0 MM 나트륨 구연 산염 (10g / L) 16.6 MM MgSO 4 (2g / L) 최종 볼륨 DH 2 O 소독 필터

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

모두 prokaryotes와 eukaryotes는 생리적 변화 복잡한 설정을 통해 DNA 손상에 대응. 유전자 표현, 기존의 단백질의 재배포, 새로운 단백질 단지의 어셈블리에 변경이 DNA의 병변과 일치하지 않는 DNA 기본 쌍 다양한 자극에 의​​해 수 있습니다. 형광 현미경은 DNA의 병변과 살아있는 세포의 복잡한 subcellular 구조 내의 DNA 복제 상태를 모니터링하기 위해 이러한 행위나 기타 가능한 답변을 시각화하고 quantifying을위한 강력한 실험 도구로 사용되고 있습니다. 형광 기자 단백질과 DNA 복제 및 복구 기계의 구성 요소 사이의 Translational fusions는 단서를 결정하는 데 사용되었다는 그들의 동족의 병변을 대상 DNA 수리 단백질<em&gt; 생체내에</em&gt; 이러한 단백질이 세균의 세포 내에 구성되는 방법을 이해합니다. 또한, DNA의 손상 inducible의 발기인에 연결되어 transcriptional과 translational fusions는 인구 내에서 세포가 genotoxic 스트레스 반응을 활성화하는 공개했습니다. 이 리뷰에서는, 우리는 이미지를 DNA 수리 및 단일 박테리아 세포의 DNA 복제 단지의 어셈블리를 형광 현미경을 사용하여에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 특히,이 작품은 영상 불일치 복구 단백질, 상동 재조합, DNA 복제 및 SOS - inducible 단백질에 초점을 맞추고<em&gt; 바실러스 subtilis</em&gt;. 여기에서 설명한 절차의 모든 세균 종의 다양한 영상 단백질 단지에 대해 쉽게 의무가 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis at JoVE.com

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

자세한 프로토콜은 이미징을 위해 DNA 수리 단지의 실시간 형성을 설명<em&gt; 바실러스 subtilis</em&gt; 세포.

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

10.9K 조회수.  University of Michigan-Ann Arbor. 자세한 프로토콜은 이미징을 위해 DNA 수리 단지의 실시간 형성을 설명 바실러스 subtilis 세포.

비디오: Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

연구

생물학

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축<em&gt; BRCA1</em&gt;<em&gt; BRCA2</emDNA 손상 복구에 참여&gt;, 9 유전자

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...