우리의 연구는 생물 공학 및 생물 과학 연구위원회에 의해 지원됩니다. 우리는 친절 CFP-LC3의 발현 플라스미드으로 우리를 공급하기위한 교수 길이 요시모리에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 세포의 준비 <ol><li> (2 후 80 %의 confluency에 대한 목표 30-40%의 자랄 때에, Dulbecco 수정 이글스의 중간 (DMEM)에서 하룻밤 배양 세포, HEK - 293T 세포의 씨앗 낮은 통로 번호가 안정적으로 22mm 라운드의 coverslips에 GFP-DFCP1을 표현 일 - 라이브 셀 이미징 일). </li></ol> 2. 세포 형질 <ol><li> 나는 혈청 배지, 3 μL X-tremeGENE 9 DNA의 형질 시약 및 pECFP-LC3 플라스미드 DNA 0.5 μg을 감소 100 μL OptiMEM을 포함, 각 플레이트 형질 복잡한 믹스를 준비합니다. 그리고 위아래로 pipetting하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 알을 품다. [참고 : 우리는 반복적으로 같은 lipofectamine과 2000 다른 형질 시약, 독성의 많은 것을 발견하고, 또한, 그들은 많은 현미경 기술을 방해 자신에 형광 입자를 생산하고 있습니다.] </li><li> 접시에서 매체를 대기음 신선한 DMEM 미리 예열 37 ° C.를 추가 </li><li> 트란 추가24 시간 동안 배양 세포, pipetting하여 세포에 복잡한 sfection. </li></ol> 3. 세포 소기관 마커 (선택 사항)와 세포 배양 <ol><li> 75 nm의 최종 농도에서 DMEM에 mitotracker / lysotracker를 추가하고, 빛의 노출과 반복적 동결 융해 사이클을 방지하기 위해, 전체 실험의 날 함께 알루미늄 호일로 덮여 팔콘 튜브에 얼음 계속. </li><li> mitotracker / lysotracker 함유 배지 2 ㎖의 나누어지는을 제거하고 37 ° C에서 예열, 형질 세포 흡인 중간 mitotracker / 30에 대한 중간 및 부화 세포를 함유 lysotracker로 교체 - 60 분. </li></ol> 4. 라이브 셀 이미징에 대한 배양 챔버의 준비 (그림 1) <ol><li> 깨끗한 금속과 75 %의 에탄올과 금속 O-링의 테두리에 실리콘 그리스를 도포와 O-링 플라스틱. </li><li> 집게는 접시에서 coverslip을 제거하고 coverslip에의 바닥면에서 매체의 과잉 건조하여,이 같은 그리스 너무 많은 매체를 혼합하지 않도록하려면 누설의 가능성을 증가합니다. </li><li> 밀폐 챔버를 창조하기 위하여 사이에 끼워 coverslip에 함께 플라스틱 O-링의 선반에 휴식 및 플라스틱 O-링의 상단에 금속 O-링에 맞게 coverslip을 둡니다. </li><li> 판의 매체와 최고 챔버, DMEM의 중탄산염 버퍼 시스템은 인공 CO 2 농도를 필요로이 점에서 그리고에, 발생하는 산도의 변화를 방지하기 위해, 버퍼링 에이전트없이 DMEM 배지에서 세포의 장기 배양을 방지 10 %의와 주위 공기의 CO 2 농도는 매우 낮습니다. </li></ol> 5. 세포의 기아 <ol><li> 현미경 스테이지에서 배양 챔버를 넣습니다. </li><li> 전체 매체를 대기음 기아 매체의 2 ㎖ 3 회 씻어, 더 아미노산 결국 자식 작용 반응을 억제 할 DMEM에서 유지되지 않았는지 확인하며 설정ON 타이머. </li></ol> 6. 현미경 사용 <ol><li> 살아있는 세포 넓은 분야 에피 형광 위해 구성된 적절한 이미징 시스템이 필요합니다. 이는 일반적으로 연구 등급 거꾸로 현미경 구조, 형광 단백질 (들) / 그 염료 (들), 높은 품질의 대물 렌즈, 민감한 CCD / sCMOS 특정 강렬한 광범위한 스펙트럼 광원, 거울과 필터를 구성합니다 카메라와 배양 챔버. (모든 주요 현미경 제조 업체 라이브 셀 이미징에 적합한 완벽한 넓은 필드 시스템을 제공하지만, 제조 업체의 다양한 구성 요소를 사용하여 시스템을 홈 구축도 가능하고 같은 마이크로 Manager와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여이를 제어 <a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">: HTTP / / valelab.ucsf.edu ~ / MM / MMwiki /</a> ). 우리의 생각에 가장 중요한 부분은 형광 기자의 발현 수준을 최소로 유지 될 수 있도록 고감도의 시스템을 사용하는 것입니다. </li><li> SEL이미지에 적절한 셀을 변경 합니다. <ol><li> 더 autophagosome 대형 이벤트를 캡처 할 수 있도록 대형 및 평면 셀을 선택합니다. 또한, 이미 omegasomes의 큰 숫자를 생산하기 시작했습니다 셀을 선택. </li><li> 비디오 당 autophagosome 대형 이벤트의 큰 비율을 캡처하기 위해, 30 분 후 또는 잘 autophagy에 대한 응답으로 비디오 캡처를 시작합니다. </li></ol></li><li> 영상. <ol><li> 높은 배율 렌즈 (100X 1.4 NA)를 사용합니다. </li><li> 사진 표백을 방지하기 위해 최대 20 %까지 여기 빛의 강도를 조정합니다. </li><li> 100-500 밀리 초 노출 × 2 비닝 (binning) 100 이득 카메라 (하마 마츠 ORCA ER, 픽셀 크기 6.45 μm의)을 설정합니다. </li><li> 이미지 수집 속도 1 프레임마다 10 초로 설정합니다. </li></ol></li></ol> 7. ImageJ에 함께 Autophagosome 대형 이벤트의 몽타주 만들기 [이 단순히 전자의 병합 된 비디오를 스캔하여 비 체계적인 방법으로 수행 할 수 있습니다관심 통풍구하지만, 아래에 설명 된대로 그것은 또한 체계화 될 수 있습니다.] <ol><li> 3 (또는 2) 오픈 이미지 스택은 ImageJ에 / 피지 채널을 캡처. </li><li> 해당 채널에 녹색, 빨간색과 파란색 LUT (룩업 테이블)을 적용, 3 색상을 병합하고 저장합니다. </li><li> 분석 탭에서 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자를 선택 ... &gt; 지정한 후 스택의 첫 번째 이미지에서 정의 된 크기의 임의의 영역을 선택합니다. </li><li> 이미지 탭에서 스택의 선택된 영역을 복제하기 위해 복제를 선택합니다. </li><li> 이미지 탭에서 스택을 선택&gt; 몽타주를 만들기 ... 포함하는 임시 몽타주를 만들려면 모든 프레임 캡처. 전체 autophagosome 형성 이벤트 장면에서 모든 프레임을 스캔하면 이벤트의 처음과 마지막 프레임의 노트를 유지합니다. </li><li> 분석 탭에서 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자를 선택 ... 다른 2 색이 스택의 첫 번째 이미지뿐만 아니라 병합 색상 이​​미지에 대해 동일한 영역을 선택하고 스택을 복제합니다. </li><li> t에서그 탭을 파일, 새로 만들기&gt; 이미지를 선택하고 높이 설정 한 투자 수익 (ROI) 관리자를 사용하여 처음 선택한 픽셀의 수에 따라 폭 설정의 4 배 투자 수익 (ROI) 관리자에서 설정 높이를 더한 3 색과 사이의 공간에 대한 3 픽셀 각 스택 프레임의 수와 병합 및 설정 조각입니다. </li><li> 이미지 탭에서 선택한 스택&gt; 도구&gt; 삽입 ..., 그 사이에 1 픽셀의 공간을두고, 다른 상단에 각 하위 스택 하나를 삽입합니다.에게 </li><li> 이미지 탭에서 스택을 선택&gt; 몽타주를 만들기 ... 몽타주 시작 및 캡처 autophagosome 대형 이벤트의 처음과 마지막 프레임 마무리를 만들 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서 설명하는 방법은 autophagosome 형성하는 동안 단백질의 지방화 시각화 할 수 있습니다. 우리는 이벤트 디스크 공 촛점과 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 회전, 포인트 스캐닝 공 촛점을 포함한 기술 시각화하는 다양한 방법을 시도했다. 우리는 일반적인 목적을 위해 표준 넓은 분야 에피 형광 감도와 해상도 사이의 최고의 타협을 제공하는 것으로 나타났습니다. 이 잡음을 최소화 pho...

autophagy에 1-3 autophagosome 형성의 최종 결과에 대한 단백질의 다수의 조정을 필요로하는 매우 역동적 인 과정이다. 현미경은 아마도 가장 일반적으로 autophagy에 4 공부에 적용하는 기술이다. 대부분의 자식 작용 단백질의 지방화는 광범위하게 모두 내생 단백질을 면역 염색 및 형광 태그 외인성 단백질의 표현으로, 고정 세포에서 연구되어왔다. 또한, 전자 현미경 (EM), 혼자 면역 골드 라벨,와 함께 이러한 구조 5,6의 정밀한 세부 사항을 설명하고있다. 시간 -이 기술은 공간의 3 차원 autophagosome 형성에 대한 우리의 이해를 설립 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 4 번째 차원에 대한 정보의 충분한 양을 제공하는 데 실패했다. 이 possi 가까이로 autophagosome의 형성에 따라 허용하는 라이브 셀 이미징이 장벽을 극복실시간 7 BLE. 이 기술은 처음 요시모리와 동료 8로 자식 작용을 연구하기 위해 사용되었고, 점점 이제부터 사용되었습니다. 시간 경과 현미경은 살아있는 세포에서 POI의 시간의 기간 동안 현지화를 캡처합니다. 잘 특성화 자식 작용 및 / 또는 세포 소기관 마커로이 정보를 비교하여 라이브 셀 이미징 분석 autophagosome 형성의 큰 공간과 시간적 맥락에서 POI를 넣을 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 분석 autophagosome 형성의 단계에 따라 POI 현지화의 반복적 캡처를 기반으로 고정 된 세포의 이미지가 하나의 캡처를 기반으로하는 동안.에게 고정 된 세포의 영상은 그들의 생명주기의 다른 단계에서 동시에 캡처 한 여러 autophagosomes에서의 평균 현지화에 기반 POI의 역할을 가정 할 수있는 동안 따라서, 라이브 셀 이미징, autophagosome 형성의 특정 단계에서 POI의 기여를 입증 할 수CLE. 라이브 셀 이미징 높은 분석력하는 방법이지만, 그것은 고려되어야 할 몇 가지 본질적인 한계를 가지고 있습니다. 첫째로 모두의, 라이브 셀 이미징은 하나 이상의 외래 찬란 단백질의 발현을 필요로합니다. 형광 태그의 크기가 큰 경향이 있으며 때로는 입체 이유로 단백질의 동작을 변경할 수 있습니다. 그들이 막 2 차원의 제한된 공간에서 작동하는 데 필요한만큼이 상황은, 막 단백질에 대한 강조된다. 참고로, autophagosomes는 막 구조이며, 그에 따라 형성 막 관련 단백질의 다수를 필요로합니다. 문제의 또 다른 세트는 POI의 발현 수준에 연결됩니다. 원칙적으로, 외인성 단백질은 내인성 단백질에 비해 수준에서 표현되어야한다. 이 하위 세포 지방화의 중요한 규제가 포화되지 않도록 보장하며, 일전자 분석은 생물학적으로 관련이있을 것입니다. 그들은 내생 수준 위에 표현 될 때, 그들은 autophagy에 응답 9을 억제하는 경향 또한, 자식 작용 단백질의 과발현은 피해야한다. 반대로, POI의 발현 이후 사진 표백하지 않고 시간의 좋은 기간에 대한 지역화에 따라 수 있도록 충분히 높아야한다, 타협에 도달 할 수있다. mammalians 세포에서 외인성 단백질의 최적 발현 수준을 달성하는 것은 미세 조정이 많이 필요하지만 안정적으로 POI의 다른 수준을 표현하는 세포 라인을 확립하고 심사에 의해 가능한 것입니다. 표준 형광 현미경으로 얻을 수있는 공간 해상도는 또 다른 제한 요인이다. 해상도는 이유로 제한 될 수 있습니다,하지만 기껏 수평 해상도는 250 nm의 주위에있을 것입니다. 이것은이보다 작은 거리로 구분하는 개체 (또는 단일로 연결 표시된다는 것을 의미합니다개체)와 250 nm의보다 작은 개체가 실제로보다 큰 이미지로 표현됩니다. 따라서 이미지는 항상 염두에두고 해석해야하고 EM 등의 보완 기술은 미세 매우 구조적 세부 사항을 확인해야합니다. 마지막으로, 라이브 셀 이미징은 본질적으로 오랜 기간 동안 잠재적으로, 빛에 세포를 노출해야합니다. 이 세포 사진 독성으로 알려진 현상​​의 생리적 반응을 변경할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 autophagosomes는 ER 가닥 10,11과 밀접한 관계에있다 PI3P 풍부한 고리 같은 구조라고 omegasomes에서 발생하는 첫 번째 시간을 설명하는 PI3P 결합 단백질 DFCP1의 라이브 셀 이미징을 사용했습니다. 우리는 명확하게 LC3 양성 구조 omegasomes와 긴밀한 관계 형성을 시작하는 것으로 나타났습니다. 우리는 여기서 세포 라인을 채택하는 것은 안정적으로 라이브 셀 GFP-DFCP1을 표현하는 것이 좋습니다관심의 단백질의 영상은, autophagosome 형성에 역할의 특성에 대한 강력한 공간과 시간 프레임을 설정합니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

autophagy에 특히 영양소, 아미노산의 부재의 부족에 의해 발생 세포 반응이다. 자식 작용은 세포질, 수명이 긴 단백질도 단백질 집계, 결함이있는 세포 소기관, 바이러스 또는 박테리아를 격리 할 autophagosomes라는 이중 막 구조의 형성에 의해 정의됩니다. Autophagosomes 결국 생성 된 영양소가 세포질로 재활용되고 함께 자신의 콘텐츠를 대량으로 저하로 이어지는 리소좀과 융합. 따라서 자식 작용은 세포의 항상성을 위해 중요하고, 자식 작용의 조절 장애는 질병, 특히 신경 변성, 노화 및 암으로 이어질 수 있습니다. Autophagosome 형성 세포가 핵심 autophagy에 기계라는 단백질의 특정 그룹을 할당 한되는, 매우 정교한 과정이다. 핵심 autophagy에 기계는 기능, 다양한 세포 과정에 관여 추가적인 단백질에 의해 보완 membran의 예입니다미토콘드리아와 리소좀 생물학 전자 매매. autophagosomes의 형성과 분해 이러한 단백질의 조정은 자식 작용의 매우 역동적이고 정교한 응답을 구성합니다. 라이브 셀 이미징 하나 하나 autophagosome 대형 이벤트의 수준으로 각 autophagy에 관련된 단백질의 분자 기여를 따라 할 수 있으며 실시간 따라서이 기술은 높은 공간적 해상도를 제공합니다. 여기에서 우리는 우리의 분석을위한 공간적 컨텍스트를 설정하기 위해, 안정적으로 GFP-DFCP1을 표현하는 세포 라인을 사용합니다. autophagosomes 형성에 선도적 인 전구체 구조입니다 DFCP1 마크 omegasomes. 관심 (POI)의 단백질은 적색 또는 청록색 형광 태그 하나와 함께 표시 할 수 있습니다. 미토콘드리아와 리소좀 ER 같은 다른 세포 소기관은, 모든 autophagosome 형성의 여러 단계에 관여하고 있으며, 특정 추적기 염료를 사용하여 표시 할 수 있습니다. AUTOP의 경과 현미경이 실험 세트 업의 hagy이 정보는 4 차원, 즉 시간에 대한 추출 할 수 있습니다. 따라서 우리는 공간과 시간에서 자식 작용하는 POI의 기여를 볼 수 있습니다.

프로토콜이 설명에서 우리는 안정적으로 autophagy를 유도 조건 하에서 GFP - 태그 DFCP1을 표현하는 세포 라인 CFP-태그 LC3의 국산화를 따라 시간 경과 현미경을 사용했습니다. 이 실험의 결과는 2 시리즈 또는 GFP-DFCP1와 CFP-LC3에 해당하는 이미지, 녹색에서 하나 파랑 채널에서 하나의 스택의 캡처입니다. 우리는 더 이상 같은 프로토콜 절에 설명 된 단일 autophagosome 대형 이벤트에 해당 몽타주를 작성하?...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.4K 조회수.  The Babraham Institute. 찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

비디오: Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

연구

생물학

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...