라이브 세포 이미징은 단일 세포 내에서 시간이 지남에 따라 동적 세포 프로세스를 관찰할 수 있습니다. 이 접근은 세포 분열의 동적 프로세스에 영향을 미치는 조건을 평가하고 미토시스에 있는 결점이 딸 세포 증식 및 생존에 미치는 충격을 밝히기 위한 강력합니다. 이미징 중 광 노출로 인한 광독성은 이 프로토콜과 관련된 중요한 과제를 나타냅니다.
따라서 노출 시간과 이미징 간격 및 지속 시간을 최적화해야 합니다. 무균 기술과 생물안전 수준 2안전 캐비닛을 사용하여, 멸균 일회용 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 발현 구조를 운반하는 세포줄을 포함하는 배양판으로부터 배지를 흡습한다. 간략하게 소용돌이와 멸균 PBS의 10 밀리리터로 세포를 세척하고 0.05 %의 트립신의 두 밀리리터로 세포를 치료.
섭씨 37도에서 2~5분 후, 8밀리리터의 신선한 배지를 접시에 추가하여 반응을 멈추고 부드러운 파이펫팅으로 분리된 세포를 다시 중단합니다. 세포 용액을 멸균 15 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. PBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세포를 원심분리합니다.
셀 배양 배지 농도의 밀리리터 당 1~2회 10회 세포에 세포를 1~2회 희석시키기 위한 배지의 10밀리리터에서 펠릿을 재중단한다. 그런 다음 멸균 12웰 이미징 바닥 플레이트의 각 웰에 세포의 500 마이크로리터를 시드하고 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치하여 세포가 플레이트 표면에 부착할 수 있도록 합니다. 이미징 하기 전에 30 분 이상, 하나 이상의 우물에 미토 틱 약물의 관련 농도를 추가 하 고 컨트롤과 같은 수의 우물에 희석제희석제의 동일한 볼륨을 추가.
이미징용 현미경을 준비하기 위해 고해상도 카메라가 장착된 반전 된 상피 성화 현미경의 단계에 플레이트를 배치하고, 섭씨 37도에 예열된 환경 챔버및 가습 5 % 이산화탄소를위한 전달 시스템. 0.5의 수치 조리개와 높은 대비 형광 및 위상 대비를 위해 장착된 20배의 공기 목표를 선택하거나, 밝은 필드 이미징을 장착하고 세포를 바라보며 과정을 조정하고 세포를 초점으로 데 초점을 맞출 수 있습니다. 밝은 필드, GFP 및 RFP 이미지 수집에 대한 최적의 노출 시간을 설정하려면 이미지화될 형광에 대해 적절한 여기및 방출이 있는 각 필터 큐브를 선택하고 재생을 클릭합니다.
신호가 충분히 강렬하지 않은 경우 자동 노출을 조정하고 각 플루오로포어 채널에서 포맷 드롭다운 메뉴에서 적절한 비닝을 선택합니다. 제조업체의 지침에 따라 현미경 단계를 멀티 웰 접시로 선택하고 보정하고 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 이미지 이미지를 강조하거나 이미지할 우물을 선택합니다. 생성된 점 제어판을 열고 작업 영역 에서 제한된 및 테두리를 선택하여 좌표 선택 영역을 제한하여 웰의 경계를 제외합니다.
영역 제한 드롭다운 메뉴에서 전체 영역을 선택하고 임의점 배치를 선택합니다. 카운트를 6개로 설정하고 Randomize를 클릭하여 각각 잘 캡처할 포인트의 수와 분포를 선택합니다. 그런 다음 시간 시퀀스 제어판에서 값을 클릭하고 입력하여 이미지 수집 시간 간격과 기간을 선택하고 입력합니다.
RFP-H2B 표지 크로마틴을 시각화하려면 RFP 필터 큐브로 캡처된 이미지를 선택하고 초기 크로마틴 다짐 및 핵 봉투 분해에 의해 표시된 바와 같이 미토시스를 입력하는 세포를 식별하여 개별 세포에서 메타위상 정렬 및 상 발병의 미토틱 타이밍을 결정한다. 획득된 영화의 연속 시간 지점을 통해 관심셀을 추적하여 MIP-H2B 라벨이 부착된 크로마틴이 메타상 동안 셀 적도에서 정렬을 완료할 때까지 미토틱 항목으로부터의 시간 포인트 또는 분 수를 결정합니다. 미토성 타이밍, 미토틱 충실도 및 세포 운명을 모니터링하기 위해, 항상 염색체 분리가 명백하고/또는 크로마틴 디압축 및 핵 봉투 개혁이 발생한 시좌를 확인하기 위해 연속시간 지점을 통해 세포를 계속 추적한다.
그런 다음 RFP-H2B를 시각화하여 해부학 염색체 분리 중 염색체및 염색진 다리를 뒤들이는 것을 포함하여 미토틱 결함을 나타내는 각 집단의 세포를 식별합니다. 알파 튜룰린-EGFP를 시각화함으로써 스핀들 장애를 경험하는 세포가 스핀들 풀 포커스가 달성되고 양극성 미토틱 스핀들이 세포 분열에 대비하여 형성됨에 따라 동적 변화를 겪는 것을 관찰할 수 있다. 스핀들 어셈블리와 동시, 염색체 운동은 염색체 정렬 및 분리 충실도를 평가하기 위해 RFP-H2B와 함께 시각화될 수 있다.
살아있는 세포 화상 진찰 접근을 사용하여, 이 대표적인 결과는 일반적인 중구 적인 내용을 가진 세포가 30 분 안에 양극성 분열을 달성하기 위하여 메타위상 정렬 및 anaphase 개시를 통해 핵 봉투 고장에서 진행할 수 있다는 것을 보여줍니다. 여분의 중구가 있을 때, 세포의 거의 50%는 일시적인 다극성 미토틱 스핀들을 극복하고 완전한 세포 분열에서 양극성 스핀들을 형성할 수 있다. 나머지 세포는 양극성 스핀들을 달성할 수 없으며 그 결과 다극성 분열을 통해 미토시스를 종료합니다.
스핀들 양극성이 달성되는지 여부에 관계없이, 추가 중심을 가진 세포는 2개의 중척추를 가진 세포에 비해 미토시스의 현저하게 증가한 기간을 전시합니다. 미토성 진행의 역학이 미토틱 결과의 변화가 명백하지 않더라도 변경될 수 있음을 나타냅니다. 형광 채널의 노출 시간을 정의할 때 노출 시간을 최적화하여 광독성을 제한합니다.
또한 카메라 픽셀 비닝을 선택하여 노출 시간을 낮출 수 있습니다. 이 절차는 약리학적 검사, 침입 및 마이그레이션 분석에 응용 프로그램이 있습니다. 이러한 접근은 또한 약물 치료의 효능 또는 세포 운동성의 역학을 검사 하기 위해 사용할 수 있습니다.
