우리의 프로토콜은 뷰어의 암 침입을 차단하는 유전자 또는 유전자 조합의 효율적인 식별을 허용합니다. 문화를 통해 유지 보수를 위해 고급 동물 시설을 필요로하지 않습니다. 전체적으로 일반 또는 일반 특수 라이브러리는 몇 주 만에 뷰어로 상영될 수 있습니다.
이 이상 선별 시스템은 연구원이 암 전이를 차단하기 위하여 이용될 수 있는 새로운 치료 유전자 표적 또는 유전자 표적 조합을 발견하는 것을 도울 것입니다. IV 주입의 경우, 세포를 희석하거나 다시 중단하기 위해 얼음 감기 1X PBS를 사용하여 밀리리터당 0.5~ 1백만 개의 세포에 세포를 농축합니다. 10개의 태아마다 약 1밀리리터의 세포 현탁액이 필요할 것으로 예상됩니다.
주사 장치를 조립하려면 주사기에 바늘을 장착한 다음 3~5센티미터 길이의 튜브조각으로 주사기 바늘을 확장합니다. 미세 한 집게를 사용하여 보로 실리 케이트 바늘의 끝을 깰. 암 세포 현탁액의 50~ 200 마이크로리터로 주사기를 적재합니다.
그리고 튜브에 borosilicate 바늘을 삽입합니다. 세포 막힘 및 기포에 대한 바늘을 검사합니다. 모세관 내에서 세포 막힘이 관찰되면 모세관을 제거하고 세포를 다시 일시 중단하고 새로운 모세관으로 대체하십시오.
플런저를 사용하여 거품을 밀어내보도록 합니다. 커버 뚜껑을 제거하고 입체 범위 아래에 배아를 전달합니다. CAM 표면에 주입할 적절한 정맥을 식별합니다.이는 일반적으로 보로실리케이트 바늘 팁의 직경보다 약간 더 넓으며 배아와 계량 접시 벽 사이에 중간에 위치합니다.
일반적으로 정맥 분기에 즉시 인접한 지점에서 주입하는 것이 더 쉽습니다. 혈관 벽에 바늘의 끝을 누르고 혈류와 같은 방향으로 부드러운 압력을 적용합니다. 필요한 경우 면봉을 사용하여 주입되는 선박을 고정하거나 안정화하십시오.
원하는 부피가 주입될 때까지 주사기 플런저를 2~10초 동안 부드럽게 누르십시오. 주사 부위에 과도한 출혈이나 명확한 액체 축적이 나타나면 배아를 폐기하십시오. CAM에서 바늘을 제거하고 혈액 이나 과잉 암 세포를 제거 하는 면 봉면으로 주사 사이트를 부드럽게 두드려.
계량 접시에 주입된 배아를 뚜껑으로 덮고 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 모든 배아가 주입될 때까지 절차를 반복하십시오. 박테리아 또는 곰팡이 오염 또는 사망을 위해 배아를 육안으로 검사합니다.
그리고 실험실 처리 절차에 따라 오염된 배아를 폐기하십시오. 전이성 식민지가 처음 1~3일 동안 제복을 입고 나타나도록 한다. 그리고 4~5일 후 주사 시 침습적 또는 비침습적 전이성 식민지를 식별한다.
5일째 주사 후, 인큐베이터에서 배아를 제거하고 전이성 식민지 분포를 위해 배아 CAM을 검사하고 찾습니다. 해부 현미경하에서, 미세한 집게를 사용하여 위쪽으로 관심의 전이성 식민지를 포함하는 CAM 조직을 부드럽게 당기고, 외과 가위로 잘라. CAM 조직을 빈 멸균 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 튜브 뚜껑을 닫습니다.
관심있는 모든 식민지가 별도의 튜브로 수집 될 때까지 절제 절차를 반복하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브에서 CAM 조직을 부드럽게 다진 후, 각 식민지에 대해 별도의 멸균 18 게이지 바늘을 사용한다. 1X 콜라겐-A 용액 100마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
세포와 CAM 조직을 주변 온도에서 5분 동안 300배 G로 회전시합니다. 콜라겐-A 용액을 흡인하고 셀라인에 대한 불완전한 매체를 다시 중단한다. 그런 다음 세포와 조직을 다시 회전시십시오.
완전한 매체 및 선택 계수의 1 밀리리터에서 세포 및 조직 조각을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 12웰 의 단일 조직 배양 접시로 잘 옮김합니다. 다음 1 ~3 주 동안, 성장과 오염에 대 한 매일 암 세포를 모니터링.
세포가 70~80%에 도달하면 더 큰 양문화 접시로 옮킨다. 적절한 암 세포 수에 도달하자마자 시퀀싱 또는 다음 선발 라운드로 진행하십시오. 실패한 주입 때문에 암세포의 축적을 표시하는 태아는, 모세 혈관의 대부분에서 볼 수 있습니다.
최적의 세포 농도 및 주사 지속 시간이 달성되면, 5일째 주사 후 형질전환세포는 CAM 조직에 흩어져 있는 암세포에 의해 결정되는 바와 같이 대부분의 식민지가 침습적으로 다양한 식민지 표현형을 생성해야 한다. 주의는 컴팩트하게 나타나고 집게와 가위 및 CAM 조직의 한 조각으로 절제 될 수있는 이웃 식민지에서 충분히 멀리 위치한 전이성 식민지에 지불해야합니다. 격리된 양수 화면 히트는 재주입 시 소형 콜로니 표현형을 표시해야 합니다.
암 세포 혈관 접촉의 측정을 위해, 혈관 벽 얼룩 밝기에 주의를 기울여야하며 혈관 벽 신호에 대해 적절한 양의 렉틴을 주입해야합니다. 이 프로토콜을 시도할 때 주입 또는 과잉 주입을 피하고 과도한 출혈이나 액체 축적을 제거하십시오. 뷰어에서 암 세포 침공을 주도하는 몇 가지 새로운 유전자는이 기술을 사용하여 확인되었습니다.
