우리는 당신에게 보여줄 것입니다 일본 메추라기 ex ovo 배양을 준비하는 방법과 암이나 미생물 감염의 광역학 진단 및 치료를 위해 융모막 막 또는 CAM을 약자로 사용하는 방법. 이 방법의 장점은 빠른 발달 성장, 작은 크기, 조직에 대한 좋은 접근 및 쉬운 취급입니다. 또한 동물 연구를 수행하기위한 3R 규칙의 원칙을 존중합니다.
방광, 폐 또는 태반과 같은 점막과의 구조적 유사성으로 인해 잠재적 약물의 생체 내 테스트, 독성 테스트 또는 이식 연구에 적합합니다. 절차를 시연하는 것은 Barbora Kundekova와 Majlinda Meta, 내 실험실의 박사 과정 학생이 될 것입니다. 시작하려면 배양 시작 전 최대 4-5 일 동안 섭씨 10도에서 15도까지 신선하거나 보관 된 수정 된 메추라기 알을 사용하십시오.
깨끗하고 손상되지 않은 알만 사용한 다음 계란 회전을 끈 상태에서 수평으로 놓인 약 54시간 동안 습도 50-60%, 섭씨 37.5도의 강제 초안 인큐베이터에서 알을 배양합니다. 계란을 회전시키지 않고 70 % 에탄올로 계란 표면을 소독하십시오. 다음으로, 장갑을 끼고 멸균 층류 캐비닛에서 작은 멸균 수술 가위를 사용하여 달걀 껍질을 열고 내용물을 6웰 배양 플레이트로 옮깁니다.
각 계란 후에 70 % 에탄올로 가위를 소독하십시오. CAM이 마르는 것을 방지하기 위해 습도가 필수적이므로 6웰 플레이트의 틈새에 약 5ml의 멸균수를 추가합니다. 다음으로, 부적절하게 기울어진 배아 또는 수정되지 않은 난자를 진공 흡인기로 흡인한 다음 80-90%습도에서 섭씨 37도의 온도를 유지하면서 추가 실험이 있을 때까지 배아를 인큐베이터에 넣습니다.
CAM이 충분히 발달되면, 보통 배아 7 일째부터 주요 혈관을 피하면서 작은 모세 혈관을 따라 CAM 표면에 멸균 된 실리콘 링을 놓습니다. 무균 조건 하에서, 실리콘 링에 30 마이크로 리터의 적절한 양의 하이퍼 리신 용액을 적용하고 80-90 % 습도에서 섭씨 37 도의 인큐베이터에 배아를 보관하십시오. 광 역학 진단을 수행하려면 보라색 여기 광을 사용하여 CAM을 조명하고 하이퍼 리신 투여 후 다른 시간 간격으로 디지털 카메라로 하이퍼 리신 및 CAM 조직 및 종양 세포의 형광을 기록합니다.
연구에 백색광에서 CAM의 이미지가 필요한 경우 빛이 hypericin의 광 활성화를 유발하므로 하이퍼 리신 투여 전과 조직 고정 직전 실험 종료 시 CAM을 기록하십시오. 하이퍼리신 도포 후 광역학 치료를 수행하려면 레이저 빔이 실리콘 링 내의 전체 영역을 덮을 수 있도록 광섬유 아래에 CAM을 놓습니다. 생체 내 조사를 수행한 후, 이 특별한 경우 제곱센티미터당 285밀리와트의 플루언스 속도로 405나노미터 레이저 광을 사용하여 광역학 치료 전후에 백색광 및/또는 형광등을 사용하여 CAM을 기록합니다.
CAM 조직을 PBS의 4% 파라포름알데히드로 배양 플레이트에 최소 2시간에서 최대 밤새 고정한 다음 파라포름알데히드를 제거하고 CAM에서 실리콘 링 내 조직의 일부를 조심스럽게 잘라냅니다. 이 모든 단계는 흄 후드에서 수행해야합니다. CAM 조직으로부터 절단된 부분을 물에 10분 동안 세척한 다음, CAM 조직을 70%에탄올에 3분 동안, 에오신 용액에 2분, 트로신 96%에탄올에 5분, 100%에탄올을 5분 동안, 그리고 크실렌에서 10분 동안 2회 넣어 오름차순 알코올 계열에서 탈수시킨다.
이어서, 주걱 또는 얇은 브러시를 사용하여 페트리 접시에 용해 된 파라핀으로 가능한 한 빨리 샘플을 옮깁니다. 24시간 후 조직을 조직학적 몰드에 넣고 파라핀 매입 배지로 채우고 냉장고에서 응고시킨 다음 매립 매체에서 응고된 CAM을 절단하고 트레이에서 90도 돌린 다음 매립 배지로 다시 채우고 응고시킵니다. PDT 유발 손상을 결정하기 위해 조직 병리학 적 분석을 위해 마이크로 톰에 5-10 마이크로 미터 섹션을 준비하십시오.
조직학을 위해 냉동 CAM 섹션을 준비하려면 유리 슬라이드에 네이티브 또는 4 % 파라 포름 알데히드 고정 CAM을 조심스럽게 장착하고 임베딩 몰드를 OCT로 절반으로 채우고 액체 질소 또는 드라이 아이스와 에탄올의 혼합물에서 동결시킵니다. 동결 후 유리 슬라이드에서 CAM을 조심스럽게 기울여 동결된 OCT 매체의 상단으로 밉니다. 금형에 다시 넣고 OCT 매체로 덮고 앞에서 설명한 대로 얼립니다.
CAM 혈관 구조를 분석하려면 전체 CAM 샘플이 필요합니다. 층류 캐비닛에서 4% 파라포름 알데히드와 PBS의 2% 글루타르알데히드의 예열된 고정 용액으로 CAM을 오버플로한 다음 48시간 후에 고정 용액을 제거합니다. 그런 다음 마이크로 가위와 미세한 브러시로 CAM을 배아에서 조심스럽게 분리하고 PBS로 씻은 다음 세척 된 CAM을 유리 슬라이드에 장착하고 천천히 건조시킵니다.
그런 다음 트랜스 일루미네이터의 디지털 카메라를 사용하여 균일 한 백색광의 소스로 슬라이드를 촬영합니다. CAM 표면에서 종양의 위치는 하이퍼리신 첨가시 백색광 및 형광광 아래에서 시각화되었습니다. 조직 학적 분석은 부종 및 막 비후를 동반 한 건강한 조직을 침범하는 비정상적인 편평 세포의 동심원 구조를 보여주었습니다.
PDT로 처리 한 후, 링 내부와 주변 영역의 혈관 밀도의 명확한 차이가 관찰되었습니다. 광감작제의 존재가 없는 레이저 방사선은 어떠한 치료도 없이 대조군에 필적하는 어떠한 손상도 일으키지 않았다. 하이퍼 리신으로 3 시간 배양 한 후, 레이저 조사는 응집 된 하이퍼 리신의 단량체화로 인한 형광을 초래하여 혈관 구조에 광범위한 손상을 입혔습니다.
조직학적 분석 결과, 처리되지 않은 대조군 CAM은 비교적 균일한 두께를 가졌다. 그러나 PDT 치료로 인해 CAM이 더 얇아지고 깨지기 쉬워졌습니다. 방금 메추라기 ex ovo CAM 분석을 준비하는 방법과 사용 방법을 시연했습니다.
지침을 유지하면서 이 방법론은 마스터하기 쉽고 빠른 결과를 증명할 수 있습니다.
