이 프로토콜은 뇌 전이성 종양 세포의 형성과 미리 형성된 종양에 대한 약물 효능 및 방사선의 신속한 테스트를 허용하는 생체외 뇌 절편의 생성을 허용합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 뇌 - 종양 - 숙주 상호 작용을 유지하는 생리 학적 관련 환경에서 여러 약물 또는 치료법을 신속하게 테스트 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 뇌 전이성 세포가 어떻게 성장하고, 생존하고, 뇌 실질마를 침범하는지 이해하고 암 성장 및 확산에서 뇌 종양 미세 환경의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 Lorela Ciraku와 Emily Esquea, 내 실험실의 박사 학위 후보자가 될 것입니다. 우선, 마취 된 마우스를 입체 택시 프레임에 넣고 표준 이어 바를 사용하여 머리를 고정시킵니다. 절개 전에 요오드 면봉과 70 % 에탄올을 번갈아 가며 반복하여 머리 표면을 세 번 살균하십시오.
외과 적 메스를 사용하여 상상의 축에 대각선 각도로 한 센티미터 중간 선 절개를 만들어 마우스의 뇌를 두 개의 대칭 반쪽으로 나누어 두개골을 노출시킵니다. 면봉으로 혈액을 닦은 후 피부를 옆으로 편향시켜 주사 부위를 노출시킵니다. 0.73 밀리미터 버 비트를 사용하여 두개골에 침투하고 약간의 압력과 비틀림 동작으로 구멍을 뚫습니다.
GFP 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 5마이크로리터의 세포를 주입하려면 뇌에서 3.5mm 깊이까지 고정밀 주사기를 삽입합니다. 두 분 동안 정착 한 다음 주사기를 약 한 밀리미터 위로 당깁니다. 두 분 후, 천천히 첫 번째 절반 볼륨을 주입하고 나머지 볼륨을 주입하기 전에 또 다른 두 분 동안 기다립니다.
세 분 후에 천천히 주사기를 당깁니다. 두개골의 주사 부위에 뼈 왁스를 바르고 폴리 프로필렌 봉합사로 조직을 봉합하십시오. 수술 직후 마우스의 행동을 주기적으로 모니터링하여 빠른 회복을 돕기 위해 식염수 주사와 부드러운 음식을 포함한 특별한 치료가 필요한지 확인하십시오.
생체 발광 이미징을 통해 종양 성장을 모니터링하려면 먼저 이미징 시스템에서 산소와 이소플루란을 켜고 이미징 박스 외부의 별도의 챔버에 둘 다 분배되도록 합니다. 그런 다음 소프트웨어를 켜고 계측기를 초기화 한 후 마우스 몸체 전체를 시각화하고 캡처하는 데 적합한 옵션을 선택하십시오. 다음으로, 마우스를 산소 및 이소플루란이 공급된 이미징 박스 외부의 챔버로 옮긴다.
마우스가 마취 효과를 받으면 마우스를 복강 내 루시페린 밀리리터 당 30 밀리그램의 200 마이크로 리터로 주사하십시오. 마우스를 이미징 챔버 코 입술에 아래를 향하게하는 위장을 이미징 챔버에 놓습니다. 챔버를 잠그고 두 분 시간 노출을 선택하여 이미징을 시작한 다음 이미징을 완료합니다.
멸균 된 층류 후드에 조직 슬라이서를 놓은 후 모든 도구와 도구를 70 % 에탄올로 청소하십시오. 마우스를 안락사시킨 후, 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 수크로스-ACSF 용액에 빠르게 넣는다. 주걱을 사용하여 60mm 접시 뚜껑에 ACSF로 젖은 여과지에 뇌를 옮깁니다.
날카롭고 멸균 된 면도날을 사용하여 뇌의 바닥 부분을 포함하여 종양이 포함되지 않은 뇌의 과도한 부분을 잘라 뇌의 모양을 완벽하지 않은 큐브로 만듭니다. ACSF로 젖은 여과지 몇 장을 절단 플랫폼 위에 놓은 후 차단된 조직을 여과지 위에 놓습니다. 조직을 200~250마이크로미터 두께의 섹션으로 분할하려면 공급자 눈금자에서 절단 크기를 2 또는 2.5단위로 설정하고 절단을 시작합니다.
페인트 브러시를 사용하여 뇌 조각을 수크로오스-ACSF가 들어있는 접시에 옮기고 27 게이지 바늘을 사용하여 광학 현미경으로 조각을 분리하십시오. GFP 양성 슬라이스를 형광 현미경으로 확인한다. 그런 다음 넓은 개구부가있는 멸균 된 한 밀리리터의 깨진 피펫을 사용하여 식별 된 조각을 두 세 밀리리터의 성인 슬라이스 배지가 들어있는 새로운 60 밀리미터 접시로 옮깁니다.
그런 다음, 세 개에서 다섯 개의 슬라이스를 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 있는 각 조직 배양 삽입물 상으로 안전한 거리로 옮긴다. 인서트의 표면으로부터 과량의 배지를 제거한 후, 각 인서트 아래에 평형화된 성인 마우스 슬라이스 배지 한 밀리리터를 첨가한다. 이미징 전에 조직을 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 습도 95%에서 24시간 동안 배양합니다.
밀리리터 루시페린 용액 당 30 밀리그램의 다섯 마이크로 리터를 멸균 후드 내부의 삽입물 아래의 매체에 피펫합니다. 뚜껑이 있는 여섯 웰 플레이트를 고정식 카메라 아래의 기기의 이미징 챔버 안에 놓고 챔버 도어를 잠급니다. 소프트웨어를 열고 계측기를 초기화합니다.
시각화가 가능한 카메라 설정을 선택하고 이미지당 하나의 웰만 캡처한 후 이미징할 웰을 카메라 바로 아래에 놓습니다. ROI 도구를 사용하여 종양 모양과 크기 주위에 맞추고, ROI를 측정하고, 슬라이스에서 각 종양의 생체 발광 신호를 정량화하기 위해 총 판독값을보고하십시오. 플레이트를 멸균 층류 후드로 다시 가져온 후 포셉을 사용하여 인서트를 웰에서 약간 들어 올립니다.
배지를 흡인 후 배지를 한 밀리리터의 신선한 배지로 교체하고 인셋을 다시 우물에 넣으십시오. 슬라이스가 억제제 및 대사 산물과 같은 다양한 화합물로 처리되는 실험의 경우, 1.5 밀리리터 튜브에서 1.2 밀리리터의 뇌 슬라이스 매체에 적절한 시약 농도를 준비한 다음 1 밀리리터의 시약을 슬라이스가 들어있는 웰로 옮깁니다. MDA-MB-231 BR-GFP 루시퍼라제 세포를 누드 마우스에 주사하고, 종양이 성장하도록 허용하고, 종양이 있는 뇌를 해부하고, 슬라이스하고, 생체외 성장시키고, 종양 성장을 생체발광 영상화에 의해 모니터링하였다.
H&E 염색과 GFP 양성 형광은 뇌 절편에 종양이 존재함을 확인하였다. 증가된 Ki-67 염색은 고도로 증식성 암세포의 존재를 확인하였다. 조사에 노출되지 않은 뇌 조각의 종양은 생체 외 성장이 계속되었고, 방사선 조사에 노출 된 종양은 지속적인 성장을 보였다.
종양을 함유하는 뇌 절편은 또한 조사 처리 후 종양 성장을 가시화하기 위해 라이브 이미징을 통해 모니터링되었다. 생체 발광 영상화와 일관되게 GFP 강도가 증가하고 세포가 뇌 실질에 침입하기 시작하면서 대조군 암세포가 빠르게 성장했습니다. 대조적으로, 방사선 조사로 처리된 뇌 절편에서 암세포는 세포증식 억제되었고 GFP 강도는 유지되었다.
큰 다핵화된 암세포 및 IR-처리된 암 세포에서 DNA 손상 마커의 염색의 증가가 검출되었다. 또한, 반응성 성상세포의 증가가 검출되었다. IR 처리-유도된 아폽토시스는 종양이 없는 마우스 뇌 절편에서 검출되지 않았다.
종양을 함유하는 뇌 절편을 화학요법 약물인 파클리탁셀의 상이한 농도로 처리하였다. 치료는 치료 10 일 이후에 종양의 크기를 크게 줄였습니다. 아폽토시스의 증가는 파클리탁셀-처리된 종양 세포에서 검출되었다.
억제제 처리는 뇌 조직 생존력을 변화시키지 않았다. 아폽토시스의 증가는 파클리탁셀 처리된 종양이 없는 마우스 뇌 절편에서 절단된 카스파제-3 염색에 의해 측정되었다. 관심있는 약물에 의한 치료가 종료되면, 슬라이스는 면역세포화학, 오믹 연구를 통해 단백질 발현에 대해 분석되거나 유세포 측정에 적합한 단일 세포 현탁액을 달성할 수 있다.
