닭 초막, 또는 CAM에 종양의 이식은 종양성, 치료 효능 또는 세포 간 담론의 연구에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 생체 내성 환경에서 면역 내성에서 비용 효율적인 빠른 종양 성장을 허용합니다. CAM 모델을 사용하여, 새로운 치료 접근법은 세포주 또는 환자 종양 견본을 사용하여 급속하게 시험될 수 있습니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 측면은 적절한 CAM 형성을 보장하고 계란을 여는 동안 CAM 이나 혈관을 방해하지 않는 것입니다. CAM이 완전히 발달한 7~8일째에 계란 회전기를 끄고 약 1~3개의 계란을 생물안전 캐비닛의 달걀 랙에 넣습니다. 조명이 꺼지면 달걀 껍질에 달걀 촛불을 놓고 한 달걀의 공기 세포의 위치를 식별하고 표시한 다음 달걀 촛불을 껍질 위로 이동하여 큰 혈관 네트워크를 찾아 필요에 따라 달걀을 회전시합니다.
이상적인 혈관은 계란의 중간 근처에 분기됩니다. 마커를 사용하여 이식에 사용되는 혈관을 추적합니다. 후드의 빛을 다시 켠 후 실리콘 초경 연삭 석이 장착된 무선 회전 도구를 사용하여 쉘의 작은 구멍을 공기 셀 의 중앙을 직접 뚫습니다.
대부분의 쉘이 제거되었지만 흰색 내부 멤브레인이 그대로 발생하면 혈관 창이 방금 입증된 대로 열리는 또 다른 작은 구멍을 뚫습니다. 두 번째 구멍이 준비되면 18 게이지 바늘을 사용하여 공기 세포와 혈관 에 흰색 내부 멤브레인을 부드럽게 관통하여 CAM이 아닌 백색 내부 멤브레인을 돌봐 주며 드릴 영역 전체에 걸쳐 중단됩니다. 후드가 다시 켜지면 계란 촛불을 사용하여 공기 세포가 계란 끝에서 혈관 위로 영역으로 옮겨졌는지 확인합니다.
필요한 경우 원래 공기 셀 위에 구멍 주위에 피펫 컨트롤러에 삽입 된 진공 튜브를 배치하고 공기 셀을 이동짧은 버스트에 흡입을 부드럽게 적용합니다. 에어 캠 경계 내부 약 0.5센티미터의 공기 셀의 새로운 위치의 윤곽을 표시하고 새로운 공기 셀 위에 구멍을 커버 할 만큼 큰 포장 테이프조각을 수정합니다. 방금 입증 된 대로 다른 두 개의 계란을 준비 한 후, 인큐베이터에 계란을 반환하고 입증 된 바와 같이 1 ~ 3 의 그룹으로 실험을위한 추가 계란을 엽니 다.
모든 계란이 열리면, 생물 안전 캐비닛에 계란 랙에 재배치 된 공기 세포를 가진 1 ~3 개의 계란을 옮기고 CAM 또는 혈관을 방해하지 않고 세포를 통해 공기 셀 경계에 작은 선을 완전히 절단하는 원형 절단 휠이 장착 된 무선 회전 도구를 사용합니다. 곡선 가위를 사용하여 나머지 공기 셀 주위를 잘라 껍질에 창을 만들고 배아의 생존 가능성을 확인합니다. 실행 가능한 태아는 광범위한 혈관통, 명확한 알부민, 배아 운동 및 /또는 눈에 보이는 심장 박동을 표시합니다.
비생존 배아에서, CAM은 몇몇, 있는 경우에, 혈관이 존재하는 경우에, 불투명하거나 배아가 운동 또는 심장 박동 없이 작거나 결석할 수 있습니다 불투명한 나타날 수 있습니다. 셈킨 포셉을 사용하여 멸균 면공에서 작은 면 조각을 당기고 가능한 배아의 CAM 표면을 부드럽게 얼룩져 쉘 먼지와 이물질을 제거한 다음, CAM을 건드리지 않고 6~7센티미터투명 필름 드레싱으로 쉘 개구부를 덮고 열린 창문을 향한 인큐베이터로 계란을 되돌려 보냅니다. 계란 랙 조각, 계란 회전자의 가장자리 또는 압연 유지 계란을 소품에 다른 적합한 항목을 사용.
이식용 암세포 현탁액을 준비하기 위해, 원심분리에 의한 세포에 대한 관심과 퇴적물의 암세포 배양으로부터 세포를 수확한다. 잔류 배지에서 수퍼내탄을 흡인하고 기계적으로 재보전한다. 세포 현탁액을 얼음 위에 놓고 파이펫을 사용하여 세포의 양을 중간 크기로 측정합니다.
그런 다음 밀리리터 세포 외 매트릭스 당 2.7 ~ 4 밀리그램으로 보충된 중간 크기의 20~100마이크로리터에서 1~200만 개의 세포 농도로 세포를 재제한하고 성장 인자 또는 기타 관심 첨가제를 첨가합니다. 암세포 이식의 경우, 논스틱 링을 사용하여, 계란 랙에 이식될 최대 6개의 알을 놓고 투명 필름 드레싱의 가장자리를 열린 창쪽으로 굴려 조개껍질에서 필름을 제거합니다. 계란이 실행 가능하고 건강한지 확인하십시오.
이상적인 계란은 개방 된 지역의 중앙 내에 작은 분기 선박과 큰 선박을해야합니다. 곡선홍채 집게를 사용하여 멸균 되지 않는 링을 혈관 위에 이상적으로 배치합니다. 멸균 유리 교반 봉을 사용하여 CAM을 부드럽게 래브라드하고 암세포 현탁액을 링 중앙으로 피펫합니다.
모든 세포가 전달되면, 7센티미터 투명 필름 드레싱에 의해 6의 1 분기 조각으로 개구부를 밀봉하고 적절한 임플란트 지정으로 계란을 라벨. 그런 다음 껍질을 똑바로 향하여 인큐베이터에 계란을 단단히 놓습니다. 비스틱 링을 사용하지 않고 암세포를 이식하려면, 셀 서스펜션을 적절한 크기의 파이펫 팁으로 흡인시키고 팁의 상단 부분을 조심스럽게 피펫 팁을 꺼내서 팁을 멸균 10센티미터 조직 배양 접시에 수평으로 놓는다.
팁이 적재된 후, 접시를 섭씨 37도 인큐베이터에 15-30분 간 넣고 15분 후에 중합을 확인합니다. 각 팁이 접시에 배치될 때 소량의 액체가 일반적으로 누출됩니다. 이 액체를 사용하여 팁 내의 중합 정도를 추정하십시오.
매트릭스가 준비되면, 적절한 크기의 파이펫에 한 끝을 놓고 플런저를 우울하여 부분적으로 중합화된 셀 서스펜션을 CAM에 이상적으로 밀어 큰 잘 발달된 용기의 분기 지점에 이상적으로 두게 한다. 이러한 방법을 사용하여, 인간과 뮤린 난소암 세포주 와 1 차적인 종양 조각 둘 다 다른 생체 내 모형에서 관찰된 것과 일치하는 형태학을 가진 종양의 성공적인 이식 귀착되었습니다. 시험된 종양 모형의, 난소암 성장은 생물 발광 화상 진찰의 도움 없이 훨씬 덜 발음하고 전형적으로 보이지 않았습니다.
이식 시 성장 인자 또는 호르몬을 첨가하는 효과 또한 이러한 방법을 사용 하 여 테스트할 수 있습니다. 신장암을 위해, 1 차적인 인간 신장 종양에서 확립된 세포주 또는 조각에서 명확한 세포 신장 세포 암 세포의 이식은 급속하고 강력한 종양 형성을 일으킵니다. 또한, 다수의 인간 및 뮤린 전립선암 세포주 및 인간 방광암 세포주 및 1차 종양 조각이 이 모델을 사용하여 종양을 확립하는 데 사용되었다.
CAM과 혈관을 방해하지 않고 창을 열때 CAM이 셸을 준수하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 성공적인 이식 후, CAM 모델은 종양 내의 상이한 세포 유형 간의 관심 또는 상호 작용의 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다.
