이 방법은 오늘날의 까다로운 생물학적 질문에 대한 해결책을 제공합니다. 세포 내 FPOP 실험에서, 우리는 단백질 리간드 상호 작용, 단백질 단백질 상호 작용 사이트 및 형성 변화의 지구를 연구할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 세포를 성장하고 레이저에서 바로 세포 FPOP 연구를 수행 할 수 있도록 자동화 된 6 잘 플레이트 기반IC-FPOP 플랫폼의 사용이다.
이 방법은 제약 및 생명 공학 산업뿐만 아니라 주요 학술 및 임상 연구 기관, 특히 단백질 역학을 연구하는 대학의 생물학적 조사원에 사용될 수 있습니다. 먼저 플랫폼 인큐베이터를 위치 지정 단계에서 풀고 온도, 가스 및 가습기 라인을 분리합니다. 인큐베이터를 70%에탄올로 분무하여 세포 배양 후드에 놓습니다.
플랫폼 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 제거하고, 플레이트의 원래 뚜껑을 고정하고, 현미경을 사용하여 세포 의 합류를 확인한 다음, 세포 배양 후드 내부의 플랫폼 인큐베이터에 컨플루언서가 있는 6웰 플레이트를 다시 배치한다. 튜브를 잘 벽에 플러시하여 임베디드 포트를 통해 각 웰에 3개의 미리 절단된 타이곤 튜브를 삽입하고 사용자 정의 3D 인쇄 링으로 고정합니다. 펌프 인출을 위해 통합 소프트웨어 스크립트를 준비합니다.
하나의 연동 펌프를 사용하여 6개의 우물에서 셀 미디어를 완전히 제거합니다. 다른 세 개의 연동 펌프의 각 채널에서 프라임 용매는 시약이 인큐베이터 포트에 도달할 때까지 각각의 교대관에 과산화수소 및 담금절 버퍼를 주입합니다. 레이저 빔이 올바르게 기울어져 있고 무단으로 인큐베이터에 도달하는지 확인합니다.
외부 센서를 사용하여 레이저 에너지를 확인합니다. 빔 정렬을 확인한 후 펌프 주입을 위한 통합 소프트웨어 스크립트를 준비합니다. 분당 35 밀리리터에 과산화수소 200밀리머를 주입하여 첫 번째 우물에 넣습니다.
5초 마크에서 레이저 소프트웨어의 시작 버튼을 눌러 타이머의 11초 마크에서 펄스를 트리거합니다. 레이저 펄스 직후 분당 35 밀리리터에 125 밀리머 커넥드 용액을 주입합니다. 수동으로 위치 단계이동하여 다음 단계를 레이저 빔과 잘 맞추고 모든 우물에 대한 프로세스를 반복합니다.
세포 배양 후드에서 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 웰에서 개별 15 밀리리터 원문 튜브로 세포를 전송합니다. 원심분리기 세포는 5분 동안 1, 200배 G에서 세포를 제거합니다. 상체를 버리고 RIPA 리시스 버퍼의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다.
개별 1.2 밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 세포를 이송합니다. 플래시는 액체 질소에 있는 모든 견본을 동결하고 사용될 때까지 영하 80도 냉동고에 놓습니다. FPOP 수정을 국소화하기 위해 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 분석을 사용하여 소화된 셀 용액을 분석한 다음 수정 정도를 계산합니다.
플랫폼 인큐베이터 조건이 레이저 플랫폼에서 세포 배양에 충분한지 확인하기 위해 GCaMP2는 HEK293T로 일시적으로 전환되었고 두 플레이트에 대한 경질 효율을 형광 이미징을 통해 평가하였다. 루시파라제 분석체는 경질 효율을 수량화하기 위해 수행되었다. 유동 시스템에 표지된 HEK293T 셀의 FPOP 수정은 플랫폼 인큐베이터에 표시된 세포와 비교하였다.
플랫폼 인큐베이터는 변형된 단백질의 수와 해당 단백질의 총 FPOP 커버리지 모두에서 유량 시스템을 능가했습니다. 유동 시스템에서는 2개의 변형된 펩타이드가 검출되어 제한된 구조 정보를 제공했다. 그러나, 액틴 서열을 아우르는 5개의 수정된 펩타이드는 플랫폼 인큐베이터에서 검출되었다.
시스템 및 수정되지 않은 액틴 펩타이드 모두에서 변형된 프롤린을 가진 액틴의 탠덤 MS 스펙트럼이 여기에 나와 있다. 플랫폼 인큐베이터 샘플의 FPOP 수정 잔류물에는 12개의 수정된 잔류물, 유동 시스템의 3개의 수정된 잔류물, 1개의 중복 변형된 잔류물이 포함되어 있습니다. LC-MS MS 분석에 따르면 792개의 단백질이 유동 시스템으로 변형된 545단백질에 비해 플랫폼 인큐베이터에서 생체 내 FPOP에 의해 변형되었다는 사실이 밝혀졌습니다.
멸균 조건 하에서 세포를 유지하는 것이 필수적입니다. 항상 플랫폼 인큐베이터를 멸균 세포 배양 후드에 가져와 필요한 모든 6웰 플레이트, 튜브 및 링을 삽입하십시오. 이렇게 하면 실험의 무결성이 보장됩니다.
