이 방법은 DNA 메틸화에 대한 환경 요인의 영향을 평가하기 위해 시퀀싱 기반 도구를 설계하고 구현하는 방법을 보여 줌으로써 에피소드 학분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배열 기반 플랫폼에 비해 DNA 메틸화 수준을 평가하는 보다 포괄적이고 정량적인 방법을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 서열 데이터가 유효한 어떤 유기체에 있는 생리적인 프로세스의 다른 모형 때문에 DNA 메틸화 변경의 확인으로 확장합니다.
이 방법은 DNA 메틸화에 대한 스트레스의 영향에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 고지방 식단에서 환경 독성물질에 노출되고 당뇨병및 심혈관 질환과 같은 조건과 같은 다른 환경 적 요인 또는 생리적 조건에도 적용 될 수 있습니다. DNA를 전단하고 생체 분석기를 통해 크기를 확인한 후 각 샘플에 DNA 결합 자기 구슬 180 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 마그네틱 플레이트에 구슬을 펠트하고 상체판을 제거합니다.
70%에탄올의 200 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다음으로, 마그네틱 플레이트를 사용하여 구슬을 펠릿하고 가능한 한 많은 에탄올을 제거하십시오. 3~5분 동안 37°C의 열 블록에서 구슬을 건조시다.
이어서, 뉴클레아제 없는 물의 44마이크로리터에서 펠릿을 회수하고, 상류제의 약 42마이크로리터를 수집한다. 어댑터를 리게팅하고 생체 분석기를 통해 결찰을 확인한 후 샘플을 낮은 DNA 결합 미세 원심 분리튜브로 이송합니다. 그런 다음 가열 된 진공 농축기를 사용하여 3.4 마이크로 리터 미만의 샘플 볼륨을 줄입니다.
그 후 각 샘플에 5.6 마이크로리터의 메틸-세크 블록 믹스를 추가하고 열 사이클러에 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 라이브러리 혼성화 캡처를 준비합니다. 그런 다음 각 샘플에 캡처 라이브러리 혼성화 믹스 20 마이크로리터를 추가하고 16시간 동안 섭씨 65도에서 배양합니다.
인큐베이션 기간이 끝날 때까지, 새로운 8웰 스트립 튜브에 샘플 당 스트렙타비딘 자기 비드 50 마이크로리터를 추가하여 스트렙타비딘 자기 구슬을 준비한다. 메틸-세크 바인딩 버퍼의 200 마이크로 리터와 구슬을 세척. 스트립 튜브를 마그네틱 플레이트에 놓고 구슬에서 상수체를 제거합니다.
그런 다음 메틸-세크 바인딩 버퍼의 200 마이크로 리터에서 구슬을 다시 일시 중지합니다. 세척 된 스트렙타비딘 구슬에 샘플을 추가하고 회전 믹서에 30 분 동안 실온에서 배양하십시오. 샘플이 혼합되는 동안, 메틸-세크 워시 버퍼 2의 알리쿼트 200 마이크로리터는 96웰 플레이트의 삼중 웰에 넣고 섭씨 65도까지 미리 따뜻합니다.
시료가 인큐베이션된 후 마그네틱 구슬을 마그네틱 플레이트로 펠릿하고 상체를 제거합니다. 그런 다음, 메틸-세크 워시 버퍼 원의 200 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다. 실온에서 15분 동안 구슬을 배양하고 마그네틱 플레이트를 사용하여 상수판을 제거합니다.
그 후, 미리 데워진 워시 버퍼 2의 200 마이크로리터에서 비드 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음, 구슬을 펠렛하기 위해 마그네틱 플레이트를 사용하기 전에 열 사이클러에서 구슬을 배양한다. 메틸-세크 용출 버퍼 20 마이크로리터를 세척된 구슬에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
마그네틱 플레이트를 사용하여 구슬을 펠릿하고 상체를 새로운 스트립 튜브로 옮기십시오. 먼저, 이전에 수집된 상체에 비황피변환 시약 130마이크로리터를 추가한다. 150 마이크로리터 반응을 두 개의 우물로 균등하게 나눕니다.
그런 다음 열 사이클러에서 반응을 배양합니다. 600 마이크로리터의 바인딩 버퍼를 사용하여 샘플을 스핀 컬럼에 바인딩하고 100 마이크로리터의 Wash 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 열을 원심분리하고 흐름을 폐기합니다.
그 후, 열에 200 마이크로리터의 황량 버퍼를 추가합니다. 실온에서 15~20분 동안 기둥을 배양합니다. 워시 버퍼 200 마이크로리터로 컬럼을 두 번 씻으시다.
그런 다음 열에 용출 버퍼 10 마이크로리터를 추가합니다. 실온 및 원심분리기에서 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 PCR 반응 마스터 믹스를 준비합니다.
그런 다음 각 샘플에 마스터 믹스의 82 마이크로리터를 추가하고 열 사이클러에서 샘플을 배양합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 PCR 마스터 믹스 2를 얼음 위에 준비합니다. 그런 다음 각 샘플에 PCR 마스터 믹스 2와 상업용 인덱싱 프라이머의 5 마이크로리터의 25.5 마이크로리터를 추가하고 열 사이클러에서 샘플을 배양합니다.
생체 분석기에서 고감도 DNA 검출 시약으로 샘플의 DNA 농도를 평가합니다. 그런 다음 메틸-세크 라이브러리는 차세대 시퀀서에 대한 시퀀싱을 위해 제출됩니다. 비설피테 변환 및 PCR 증폭 유효성 검사 샘플 후 바인딩 버퍼, 물 및 스트렙타비딘 코팅 세파로즈 구슬로스 구슬로 마스터 믹스를 준비합니다.
그런 다음 마스터 믹스 75마이크로리터와 중첩PCR 제품의 5마이크로리터를 96웰 플레이트에 넣고 플레이트 셰이커에 15~60분 동안 흔들어 줍니다. 플레이트가 흔들리는 동안, 불꽃 분석 분석 플레이트의 우물에 프라이머 12 마이크로 리터를 추가합니다. 흔들린 후, 물로 채워진 통에 진공 공구를 놓고 공구를 바인딩 반응으로 접시에 놓습니다.
다음으로, 진공 공구를 70%에탄올, 수산화나트륨 및 트리스 아세테이트 버퍼를 포함하는 반쯤 채워진 트로프에 담급한다. 진공을 분리하고, 비즈를 전송하는 HS 피로즈퀀싱 분석 플레이트에 진공 도구를 배치합니다. 접시를 열 블록에 놓고 섭씨 80도에서 2 분 동안 배양하십시오.
마지막으로 파이로 프로그램을 시작하기 전에 접시를 5분 동안 식힙니다. 이 프로토콜에서, 메틸-세크 도서관의 분석은 스트레스와 스트레스가 없는 동물과 DM의 그래픽 플롯 사이의 차별화된 메틸화 지역 또는 DM의 순위 목록을 제공했습니다.
CpG 10의 메틸화 수준은 또한 각 동물에 대한 평균 3 주 CORT 수준에 비교되었다. 결과는 내분비와 메틸화 데이터 사이에 겸손한 상관 관계가 있음을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 DNA 전단과 어댑터 결찰 단계 사이의 평균 DNA 크기 증가를 비교하고 시퀀싱 전에 충분한 라이브러리 양을 보장하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 쥐 신경 개발에 환경 독성물질의 영향과 같은 새로운 질문에 대답하기 위해 다른 유사한 접근 법을 구현할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 후성 유전학 분야의 연구자들이 게놈 서열을 사용할 수 있는 비모델 또는 모델 유기체에 있는 게놈 전체 DNA 메틸화 변경을 탐구하는 수단을 제공했습니다. 온도에 민감한 효소를 사용하여 사용 중얼음에 보관하고 영하 20도 냉동고에 보관해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
표적 포획에 사용되는 RNA 구슬은 영하 80도 냉동고에서 사용 및 장기 저장 상태에서 얼음에 해동 및 저장이 필요합니다.
