hPSCs에서 망막 세포에 유도 과정은 복잡하고 시간이 많이 걸립니다. 이 최적화된 프로토콜은 재현성이 높고 비용이 들지 않는 망막 조직을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜의 장점은 EB 크기와 도금 밀도의 정량화로 hPSC로부터망막 유도의 효율성과 반복성을 크게 향상시키는 것입니다.
이 방법을 사용하면 모든 주요 망막 세포가 순차적으로 나타나고 망막 발달의 주요 단계를 다시 수거합니다. 망막 퇴행성 질환에 대한 질병 모델링 및 세포 치료를 용이하게 합니다. 이 절차를 시연하는 우리는 박사 과정 학생인 위안위안 관과 실험실기술자빙시(Bingbing Xie)와 함께 합니다.
DMEM의 50mL에 3차 50배 스톡 솔루션의 1mL을 추가하여 50mL의 ECM 솔루션을 준비하여 시작합니다. 그런 다음, 6웰 플레이트의 각 웰에 이 준비된 ECM 용액의 1mL을 추가하고 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양합니다. 제조업체의 지시에 따라 hPSC 유지 보수 매체를 준비하고 30 분 동안 실온으로 예열하십시오.
액체 질소 탱크에서 hPSC의 극저온 유리병을 30초 동안 섭씨 37도의 수조에 배양하여 붓습니다. 75%의 알코올 스프레이를 사용하여 조심스럽게 소독하고 바이오 안전 캐비닛에 넣습니다. 유리병에서 15mm 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.
그런 다음 5mL 파이펫을 사용하여 튜브에 미리 데워진 유지 보수 매체 드롭 바이 드롭을 5mL로 추가하고 튜브를 부드럽게 흔들어 hPSC를 혼합합니다. 5 분 동안 170 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 조심스럽게 1 mL 파이펫을 사용하여 상체의 대부분을 제거, 세포를 잃지 않도록 슈퍼 나탄의 약 50 마이크로 리터를 남겨 둡시.
위아래로 피펫팅하여 유지 보수 매체의 1 mL로 펠릿을 다시 중단합니다. 미리 코팅된 우물에서 ECM을 제거하고 각 웰에 1.5 밀리리터의 유지 보수 매체를 추가합니다. 그런 다음 각 우물에 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 분배합니다.
접시를 부드럽게 흔들어 hPSC를 균일하게 분배합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24시간 이상 인큐베이터에 넣어 세포 준수를 촉진합니다. 매일 매체를 변경하고 hPSC를 80%로 변경합니다.
Day-0에, 6웰 플레이트의 1웰에서 80%의 결합 세포를 제거하여 분화를 시작합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 EDTA 해리 솔루션으로 셀을 수집합니다. EDTA 용액을 제거하고 세포 해리를 막기 위해 10 마이크로 몰라 플루바스타틴을 함유한 유지 보수 매체 1mL을 추가합니다.
1mL 파이펫으로 셀을 수집합니다. 셀 서스펜션을 100mm 초저부착 페트리 접시로 옮기고 10마이크로몰러 플루바스타틴을 함유한 9mL의 유지보수 매체를 접시에 첨가한다. 부드럽게 균일하게 세포를 배포하기 위해 접시를 두 번 흔들어.
그런 다음 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 넣습니다. 세포가 적어도 24 시간 동안 배양 된 후 현미경으로 관찰하십시오. 15mL 튜브에 유지 보수 매체 9mL및 NIM 3mL을 추가합니다.
세포 배양을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 미리 따뜻해지는 NIM 혼합물의 10mL를 접시에 첨가한다. 튜브를 60배 G로 3분간 원심분리하여 골재를 수집합니다. 그런 다음 5mL 파이펫을 사용하여 상체를 제거하고 약 500 마이크로리터를 남기고 세포를 잃지 않도록 하십시오.
혼합물 2mL를 튜브에 넣고 서스펜션을 동일한 페트리 접시로 다시 옮기습니다. 접시를 부드럽게 흔들어 세포 응고를 균일하게 분배합니다. 그런 다음 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
5일째되는 날에는 코팅된 요리에서 ECM을 제거하고 각 요리에 10mL 사전 따뜻하게 된 NIM을 추가하십시오. Ebs가 함유된 요리를 꺼내 현미경으로 EB의 품질을 확인하여 밝고 둥글게 작동하는지 확인하십시오. 15mL 튜브에 모든 EB를 수집하고 5 분 동안 정착 할 수 있습니다.
그런 다음 대부분의 상체를 제거하고 약 2 mL의 매체를 남겨 둡다. EB를 계산한 후, 10mL의 NIM을 함유한 코팅 된 요리에 평방 센티미터 당 약 2-3 EB의 밀도로 드롭 바이 드롭을 시드하십시오. 부드럽게 탄수화물을 균일하게 분배하기 위해 접시를 흔들어 적어도 24 시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.
28일에서 35일 동안 인접한 망막 색소 상피와 함께 형태학적으로 식별 가능한 광학 소포를 기계적으로 분리하기 위해 1mL 주사기를 가진 텅스텐 바늘 또는 바늘을 사용하십시오. 현탁액으로 그들을 문화. 각 100mm 낮은 부착 배양 접시에 50-60 개의 광학 소포를 넣고 망막 오르가노이드 형성을위해 15 mL의 RDM을 함유합니다.
1일~42일까지 2~3일마다 배지를 변경합니다. 망막 분화를 시작하기 위해 hPSC는 작은 덩어리로 해리되고 서스펜션에서 배양되어 1 일 부터 EB를 형성했습니다. Day-5 EB는 ECM 코팅 배양 접시에 도금되었고 세포는 점차 적으로 EB에서 이주했습니다.
16일, 유도 배지는 RDM으로 대체되어, 신경망막 도메인이 접시에서 형성되고 서서히 돌출되는 원인이 되는 것뿐만 아니라, 세포형성 세포는 RPE 세포에 둘러싸여 있는 광학 소포와 같은 구조를 형성하였다. 일-28 에서 35 동안, RPE 구에 부착 된 신경 망막으로 구성된 망막 오르가노이드. 한쪽에는 세포가 형성되었습니다.
망막 분화 와 사양이 진행됨에 따라 hPSCs는 점차적으로 층으로 줄지어 있는 신경 망막의 특수형을 생산하여 토착 인간 망막의 건축 적 특징을 모방했습니다. 망막 신경절 세포는 망막 선조에서 처음 생성되고 신경 망막의 기저 측에 축적되었다. 이 프로토콜을 통해 망막 오르가노이드는 풍부한 막대와 콘을 모두 갖춘 고도로 성숙한 광수용체로 발전했습니다.
광수용체 세포는 apical 측에 위치하였고, 아막린 세포, 수평 세포, 양극성 세포 및 뮬러 신경교 세포는 모두 신경 망막의 중간 층에 위치하였다. 이 프로토콜의 핵심 포인트는 높은 품질의 Ebs를 만들고 올바른 밀도로 시드하는 것입니다.
