우리는 RNA 정화 프로토콜을 편집 그들의 도움을 사챠 Reichman 도미니크 Santiard - 남작 감사합니다.

1. 저널 : 외과 블록에서 표본을 복구하는 절차 실험실에서 <ol><li> 급행 선박 회사로부터 수입 계약을 얻는다. </li><li> 연구실 (전화 번호 및 이메일 주소)에서 담당자를 나타내는 실험실 우편 주소 (또는 25) 배송 ​​형태 10를 채우십시오. </li><li> (또는 25) 10 준비 샘플 양식은 10 (또는 25)에 숫자 1. 이러한 양식), 환자의) 익명 ID에 알리기 위해 수술 날짜와 C) 추가 비고란에 의사 추가을 원하십니까 B 전용 공간이 (가) 있습니다. 10 (또는 25) 덧대 진 봉투를 (150 X 210mm) 준비합니다. </li><li> (DEPC) H 2 O (GHCl를) 처리 diethylpyrocarbonate 6 M 구아니딘 클로라이드의 RNase가없는 시약 25 (또는 65) mL를 사용하여 제조. </li><li> 채우기 10 25 GHCl 용액 2.4 ml의 5 ML 멸균 폴리에틸렌 둥근 바닥 튜브를 번호. </li><li> 프레스 TI보다,이 튜브의 상단 부분을 채우기 위해 아르곤 가스를 사용ghtly 수술 캐비닛에 스토리지 몇 년 동안 GHCl 용액의 산화를 방지하기 위해 뚜껑에. </li><li> 50 ML 멸균 폴리 프로필렌 원뿔 밑바닥 관 나사 모자로 매 5 ML 튜브를 소개합니다. 50 ML 튜브에 10 ML 튜브를 보유하는 깨끗한 종이 조직의 조각을 사용하여 튜브를 닫습니다. </li><li> 패딩 봉투, 운송 양식, 샘플 형태와 골 판지 상자 폴리스티렌 랙과 랙에 50 ML 튜브를 놓습니다. </li><li> 자신의 읽기를 촉진하는 골 판지 상자 뚜껑의 안쪽에 : 지시 사항을 (1.12-1.19 참조) 붙여 넣습니다. </li><li> 병원 담당자에게 우편으로 골판지 상자를 보냅니다. </li></ol> 병원에서 <ol start="11"><li> 수술 방에 수술 장에서 골판지 상자를 가져옵니다. 주의주의 : 절차는 면역 손상 환자를 포함하는 경우, 마분지는 수술 방으로 데려 수 없습니다. </li><li> 수술하는 동안, 망막 specim 배치번호가 5 ML 멸균 폴리 프로필렌에 엉 GHCl 솔루션으로 가득합니다. 단단히 튜브를 닫습니다. </li><li> 간단히 튜브를 반환합니다. </li><li> 10 분 동안 혈액 튜브 로커에 튜브를 놓습니다. </li><li> 첨부 된 샘플 번호의 양식을 작성하십시오. </li><li> 해당 번호의 50 ML 튜브 위에 식별 번호를보고합니다. </li><li> 50 ML 튜브에 수술 시편 10 ML 튜브를 소개 티슈를 교체하고 튜브를 고정합니다. </li><li> 첨부 된 패딩 봉투 중 하나 관과 그것으로 채워진 샘플 양식을 소개합니다. 닫습니다. </li><li> 픽업 특급 운송 회사를 호출합니다. </li></ol> 2. RNA 정화 실험실에서 <ol><li> 튜브를 상하로 이동하는 동안 1 분간 균질화와 GHCl 솔루션의 5 ML 튜브 폴리 프로필렌 시료를 균질화. </li><li> 2 M 칼륨 아세테이트 산도 5.0 270 μl를 추가합니다. 그것의 뿌리에 튜브를 삽입하여 10 분 동안 격렬하게 흔들어수평 위치 (420 분 -1). </li><li> 20 ℃에서 5,000 rpm으로 (6,500 XG)에서 10 분 원심 분리 </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 부드럽게 용해 비율을 대기음. </li><li> 14 ML 멸균 튜브에 전송합니다. </li><li> 100 MM 트리스 산도 8.0, N-Lauroylsarcosine 1 %의 5.3 ML를 추가합니다. </li><li> 세슘 클로라이드 (CSCL) 3.2 g을 소용돌이로 교반하여 튜브를 섞는다. </li><li> 멸균 11 ML의 polyallomer 원심 튜브에 CSCL / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 1.8 ML를 추가합니다. </li><li> 10 ㎖ 멸균 파스퇴르 피펫, 밀도 쿠션을 방해하지 않도록 튜브의 가장자리에 천천히 밀어 1.8 ML CSCL / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 RNA 솔루션을 전송합니다. </li><li> 회 전자에 튜브를 (망막 필요없이 버퍼를 포함하는 두 번째 튜브) 놓습니다. </li><li> 20 ℃에서 32,000 rpm으로 (225,000 XG)에서 24 시간을 원심 분리기 </li><li> 멸균 파스퇴르 피펫 솔루션의 우수한 부분을 제거하고 폐기합니다. </li><li> 을 확인하면서 서서히 제거DNA가 (점성) 두 번째 멸균 파스퇴르 피펫으로 흡입하고, 그것을 폐기되어 순간. </li><li> 제 멸균 파스퇴르 피펫과 RNA 펠렛을 풀어 않도록주의하면서 남아있는 용액을 제거. </li><li> 와 튜브의 섹션 하단 메스 화염 멸균 후 거꾸로 멸균 시선 튜브의 나머지 부분을 넣어. </li><li> 튜브를 반대로 GHCl 160 μL로 섬세하게 헹구십시오. </li><li> 10 분 동안 펠릿 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 150 μL (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 0.1 % SDS 10 MM 트리스 산도 7.5)에서 펠렛을 resuspend을. </li><li> 2 ㎖ 멸균 microcentrifuge 관에 솔루션을 전송 한 후 30 ㎕의 (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 0.1 % SDS 10 MM 트리스 산도 7.5)과 잔류 펠렛을 수확. </li><li> 150 μl를 (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 MM 트리스 산도 7.5)을 추가합니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.0, 소용돌이 관의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 에탄올 100 % (-20 ° C), 소용돌이 관 900 μl를 추가합니다. </li><li> 녹는 얼음에 튜브 30 분 놓습니다. </li><li> CEN4에서 15,000 rpm으로 튜브 30 분 ° C.를 trifuge </li><li> 미묘 분획을 흡입하고, 그것을 폐기. </li><li> 500 μL 70 % 에탄올 (RT), 소용돌이 튜브를 추가합니다. </li><li> 4 15,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 20 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 세척 단계 (70 % 에탄올)를 반복합니다. </li><li> 간단히 원심 분리 P200 피펫에 남아있는 에탄올을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 펠렛 공기가 건조 보자. </li><li> 50 μL DEPC 처리 된 H 2 O의 펠렛을 resuspend을 </li><li> 로 소용돌이 적극적으로 섞는다. </li><li> 물을 욕조에 45에서 15 분 ° C를 품어. </li></ol> 3. 젤 전기 영동으로 RNA 분석 <ol><li> 화학 후드 내부의 아가로 오스 젤을 붓는다. </li><li> 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 분석 할 수있는 RNA의 2 μL 및 샘플 준비 버퍼의 6.4 μl를 추가합니다. </li><li> 두 번째 1.5 ML 튜브에 RNA 표준의 3 μL 및 샘플 준비 버퍼의 9.6 μl를 추가합니다. </li><li> 65 튜브 15 분을 가열 ° C얼음에 넣어. </li><li> RNA 샘플 튜브와 RNA 표준 관 염료로 1 μL EB로드 버퍼에 염료없이 1 μL ethidium의 브로마이드 (EB) 로딩 버퍼를 추가합니다. </li><li> 염료 중 하나 (브롬 페놀 블루) 젤 아래의 2 / 3를 도달 할 때까지 버퍼를 실행에있는 화학 후드 안쪽에 100 V, - 80 이하 젤을 실행합니다. </li><li> 젤 250 ML 데 DEPC 처리 2X SSC로 두 번 15 분을 씻어. </li><li> UV 조명 아래에서 디지털화 된 이미지를 가져 가라. </li><li> 위 밴드 (23S rRNA의)과 낮은 대역 (16 초 rRNA의) 사이의 비율을 계산합니다. </li></ol> 4. RNA의 최종 정화 <ol><li> DEPC 처리 된 H 2 O (필요한 경우) 100 μL로 RNA 샘플의 볼륨을 조정합니다. </li><li> 100 페놀 산 μL (1 ML 페놀 나트륨 아세테이트, 산도 5.2의 50 mm의 DEPC 처리 된 H 2 O + 130 μL에서 포화) 적극적으로 소용돌이. 추가 </li><li> 상온에서 13,000 rpm으로 (15,000 XG)에서 10 분 원심 분리기. </li><li> Recove연구는 새로운 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 수성 단계 (상층)을 신중하게 전송할 수 있습니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.2 에탄올 250 μL 100 % (-20 ° C)의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 녹는 얼음에 튜브 30 분 알을 품다. </li><li> 4에서 14,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 30 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 주의 깊게 분획을 흡입하고, 그것을 폐기. </li><li> 500 70 % 에탄올 μL (실내 온도)와 소용돌이 튜브를 추가합니다. </li><li> 4에서 14,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 20 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 세척 단계 (70 % 에탄올)를 반복합니다. </li><li> 간단히 원심 분리 P200 피펫에 남아있는 에탄올을 제거합니다. </li><li> 공기가 10 분 동안 펠렛을 건조 할 수 있습니다. </li><li> DEPC 처리 된 H 2 O 50 μL로 펠렛을 resuspend을 </li><li> 다음 45 관 15 분 ° C.를 품다 </li><li> RNA 샘플 2 μL에 260 nm의 280 nm에서 흡광도 (ABS)을 측정한다. 비율 Abs260/Abs280을 계산 하였다. </li> &lt;리&gt; 스토어 -80에서 RNA 샘플 ° C (몇 년 동안 안정적). </li></ol> 5. 솔루션 및 청소 절차 <ol><li> 칼륨 아세테이트 2 M, pH를 5.0 : DEPC 처리 된 H 2 O의 70 ML에 19.6 g 칼륨 아세테이트 용해 DEPC 처리 된 H 2 O 5 개의 린스 다음, 15 분간 1M NaOH를 가진에 몸을 담글으로 ph-미터 프로브를 청소 아세트산과 pH를 5.0으로 조정 후 DEPC 처리 된 H 2 O와 100 ML에 볼륨을 조정 </li><li> 트리스 - 염산 100 밀리미터, 산도 8.0, N-Lauroylsarcosine 1 %는 0.5 M 트리스 - 기본 산도 8.0 40 ML에 N-Lauroylsarcosine 2 g의 (후드) 용해. ) DEPC 처리 된 H 2 O로 200 ML에 볼륨을 조정 CSCL / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : DEPC 처리 된 H 2 O로 준비 50 ML 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 7.5 CSCL의 96g 압력솥과 DEPC 처리 된 H 2 O와 100 ML에 볼륨을 조정 pH가 &lt;7.5을 확인합니다. </li><li> 아가로 오스 겔 1 %는 : 62 ML DEPC 처리 된 H 2 O의 아가 약 1 g을 넣어 전자 레인지에서 가열한다. 12.3 M의 18 ML을 추가합니다포름 알데히드, 배 MOPS 20 ㎖. 화학 후드 안쪽에 붓는다. </li><li> 시료 전처리 버퍼 : 준비 즉흥적 수 있습니다. 배 MOPS, 12.3 M 포름 알데히드 및​​ 포름 아미드 40 μL의 16 μL의 화학 후드 8 μL 내부 섞는다. </li><li> EB 로딩 버퍼 (염료없이) : 준비 즉흥적 수 있습니다. DEPC 처리 된 H 2 O로 준비 80 % 글리세롤의 20 μL로 4 μl를 10 ㎎ / ㎖ ethidium의 브로마이드를 추가 </li><li> EB 로딩 버퍼 (염료) : 준비 즉흥적 수 있습니다. 0.25 % xylen cyanol, DEPC 처리 된 H 2 O 0.25 % 브롬 페놀 블루를 포함하는 80 % 글리세롤의 10 μL에 2 μL 10 ㎎ / ㎖ ethidium의 브로마이드를 추가 </li><li> 버퍼 실행 : 60 ML 배 MOPS로, 12.3 M 포름 알데히드의 54 ML과 DEPC 처리 된 H 2 O 186 ML를 추가 </li><li> 교반하면서 37 2 시간 동안 0.1 % v / V를 diethylpyrocarbonate에 품어 증류수 ° C : H 2 O를 DEPC - 처리. 오토 클레이브 멸균. </li><li> 균질 청소 : 1 L로 세척 용액의 25 ML (RBS)를 추가 DEPC-H 2 O를 처리하고, 교반 축이 1 분 immerge 일. 60 2 시간을 품어 ° C. 알루미늄에 DEPC 처리 된 H 2 O 랩 계기로 완전히 헹구고 장비 상자에 넣어. 상자를 포장. 오토 클레이브 멸균. </li><li> 전기 장치를 청소 : 장치, 트레이 15 우물 빗을 씻으십시오. 3 % 과산화수소에 15 분 알을 품다. 100 % 에탄올로 한 번 씻어. 건조한 공기. </li><li> 유리 접시를 청소하는 : 모든 밤 유리 접시에게 RBS 2 %를 청소 한 후 200 ℃에서 살균하기 전에 증류수로 씻어 </li></ol>

<ol>
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수술 블록의 조직 복구를위한 절차의 개발은 망막 박리의 사체 분석에 필수적이다. 하나는 수술이 유형의 비상 사태와 안과 운영들이 조작 할 때 생물학 연구 프로그램에 참여하려면 약간의 시간을 가지고 연습을 통지해야한다. 이 retinectomy는 통계 수치에 도달하는 쉬운 방법은 네트워크에서 작동하는 것입니다, 그래서 각 서비스에 확률 론적으로 수행됩니다. 이러한 네트워크, 조직 컬렉션의 표...

망막 박리의 주요 치료 목표 (RD)은 망막 색소 상피 세포에서 광 수용체의 분리로 인한 광 수용체 세포의 손상과 망막 염증을 제한하는 방법을 찾을 수 있습니다. RD 동안 RPE 세포는 dedifferentiate, 마이그레이션, 활성화되고, 합병증으로 이어지는 수축 힘을 발휘, 분리 된 망막의 표면에 확산. RD의 전사 체학 분석 RD 수술과 함께있는 최종 시력 예후를 향상시킬 수 있습니다 따라서 향후 치료 분자에 따라 수정 된 표정으로 표적 유전자를 확인하는 방법입니다. 그것은 잘 디옥시리보 핵산 (DNA)이 그대로 리보 핵산 (RNA)이 안정되지 알려진 유전 연구에 광범위하게 사용되는 후자의 안정성은 2 세 이상의 30,000 년 생물학적 샘플에서 네안데르탈 인 게놈의 시퀀싱을 허용했다. 메신저 RNA에 게놈에서 유전자의 DNA의 전사입니다주요 유전자 발현 과정 및 발현는 신호를 구성하기 위해 불안정한입니다. RNA를이 신호를 종료 RNase의 효소에 의해 매우 빠르게 분해합니다. 식을 연구 실험실에서 연구되기 전에 조직이 유기체에서 고립되면, RNA를 매우 자주 저하됩니다. 성능이 저하 된 RNA 분석을 유전자 발현에 적합하지 않습니다. 실험실 직원이 수술에 참여할 수 없기 때문에, 우리는 쉬운 절차를 개발하고 만 의사가 적절한 RNase가없는 솔루션으로 조직을 복구해야합니다. 조직의 RNA가 안정이 솔루션 실온에서 72 시간 후 분해의 부호없이 분석 할 수 있습니다. 시료에서 RNA를가 실험실 3에 전송 된 후 세슘 클로라이드 그라디언트 원심을 포함하는 표준화 된 방법에 의해 정제된다. 다음의 RNA 품질 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 및 RT-PCR에 의해 평가된다. RNA 정화 프로토콜을 가지고DNA와 RNA에 따라 다릅니다 및 RNA는 유전자 발현 연구에서 인공적인 신호를 생성하는 DNA 분자에 의해 오염되지 않도록 보장 그 밀도에 따라 분자를 분리 장점. 또한, 정량적으로 세포 내에서 가장 풍부한 RNA있는 전송 RNA를 (tRNAs를가), 리보솜 RNA (rRNAs)와 메신저 RNAs (mRNA가)되고 두 최근에서 같은 물리적 특성에 따라 분리 정제 공정의 제품을 끝낸다. 마이크로 어레이 분석 프로토콜의 대부분은 tRNA의 4-6 저해하는 역전사와 RNA 중합 효소의 사용을 포함 이후 준비에서의 tRNA의 제거에 유용합니다. 수술 표본에서 정제 된 RNA는 표준 프로토콜을 사용하여 레이블 및 마이크로 어레이 칩을 교배 그 결과는 두 개의 보완적인 방법으로, 거짓 발견 속도 방법을 사용하여 상호 정보 visuali에 따라 새로운 방법을 사용하여 분석하는웹 기반 서버 Retinobase 7,8에 데이빗.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

망막 박리 (RD)은 망막 색소 상피 (RPE)에서 감각 신경 망막의 분리를 설명합니다. RPE는 빛에 민감한 뉴런, 광 수용체의 정상적인 기능에 필수적입니다. RPE에서 망막 박리 세포 외액으로 가득 물리적 차이를 만듭니다. RD는 감각 신경 망막 이온과 대사 산물의 생리적 교환이 심각하게 교란되기 때문에 RPE 모두에 영향을 세포 및 분자 불리한 이벤트를 시작합니다. 비전에 대한 결과는 비전 1의 복원의 두 조직 결과의 신속한 reapposition 이후 박리의 기간에 관련되어 있습니다. RD의 치료는 단독으로 수술이다. 유리체 겔 (유리체 절제술)의 제거는 망막 박리를 선호하는 분리 된 주변 망막의 제거에 필수적이지 않은 부분옵니다. 제거 된 망막 표본은 고해상도 nullius (1 개)이며, 따라서 일반적으로 버려.이러한 수술 표본에서 RNA를 복구하려면, 우리는 실험실 수술 블록 전송하는 동안 RNA 보존 할 수있는 절차 일기를 개발했다. 우리는 또한 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜은 정제 된 RNA를 글로벌 유전자 발현 분석에 적합하다는 것을 보증한다. RNA의 품질은 모두 RT-PCR과 마이크로 어레이 분석에 의해 확인되었다. 데이터의 분석은 RD 동안 염증과 시세포 변성의 동시 참여를 보여줍니다.

프로 저널 (그림 1)는 우리가 정제 된 RNA에 수술 블록에서 망막의 표본을 복구하고, 망막 박리의 사체를 분석 할 수 있습니다. 단핵구 화학 주성 MCP1 유전자 CCL2의 상향 조절과 유전자 GNAT1, 단파 콘 옵신 OPN1SW 및 homeogene CRX (그림 2) transducing에로드 광 수용체의 발현 감소 망막 박리가 발생합니다. GNAT1, OPN1SW 및 CRX의 감소를 동반는 시?...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

우리는 망막 박리의 transcriptomic 분석 retinectomy에서 망막 샘플을 사용했습니다. 우리는 수술 블록과 실험 사이의 RNA 절약 할 수있는 절차를 개발했다. 우리는 정제 된 RNA를이 마이크로 어레이 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위해 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜입니다.

저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K 조회수.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. 우리는 망막 박리의 transcriptomic 분석 retinectomy에서 망막 샘플을 사용했습니다. 우리는 수술 블록과 실험 사이의 RNA 절약 할 수있는 절차를 개발했다. 우리는 정제 된 RNA를이 마이크로 어레이 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위해 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜입니다.

비디오: Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

외과 종양 표본의 Explants를 사용하여 소설 안티 - 암 의약품 개발을위한 방법


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

연구

의학

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. Recent technological progress has enabled the fabrication of microelectrode arrays that allow recording the activity of multiple individual neurons in the neocortex of the human brain. These arrays have the potential to bring unique insight onto the neuronal correlates of cerebral function in health and disease. Furthermore, the identification and decoding of volitional neuronal activity opens the possibility to establish brain-computer interfaces, and thus might help restore lost neurological functions. The implantation of neocortical microelectrode arrays is an invasive procedure requiring a supra-centimetric craniotomy and the exposure of the cortical surface; thus, the procedure must be performed by an adequately trained neurosurgeon. In order to provide an opportunity for surgical training, we designed a procedure based on a human cadaver model. The use of a formaldehyde-fixed human cadaver bypasses the practical, ethical and financial difficulties of surgical practice on animals (especially non-human primates) while preserving the macroscopic structure of the head, skull, meninges and cerebral surface and allowing realistic, operating room-like positioning and instrumentation. Furthermore, the use of a human cadaver is closer to clinical daily practice than any non-human model. The major drawbacks of the cadaveric simulation are the absence of cerebral pulsation and of blood and cerebrospinal fluid circulation. We suggest that a formaldehyde-fixed human cadaver model is an adequate, practical and cost-effective approach to ensure proper surgical training before implanting microelectrode arrays in the living human neocortex.

We designed a procedure in which a formaldehyde-fixed human cadaver is used to assist neurosurgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain.

외과 훈련 Neocortical Microelectrode 배열 포름알데히드 고정 인간 수 색 모델을 사용 하 여 이식에 대 한

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

인간 브루셀라 척추염의 진단 및 외과 적 치료

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...