형광 상관 분광기의 가장 좋은 원리, FCS, 처음에 발명되었다 1970 년대에. 1990 년대에, FCS에 대 한 중요 하 고 많은 개선 공초점 장치 현미경 검사법과 결합 하 여 설립 되었다. 그 이후로 FCS는 분자 상호 작용 및 단백질 응집 분석과 같은 많은 화학 및 바이러스 치료 응용 분야에 사용되어 왔습니다.
단백질 집계는 신경 퇴행성 질환의 특징입니다. 형광 밝기는 확산 특성에 의해 설명된 분자 크기의 작용에 있는 단일 입자입니다. 그것은 분자의 예상된 수명 주기를 결정할 수 있기 때문에 단백질 집계를 측정에 아주 중요합니다, 그러나 또한 호모 또는 이종 중합화를 구별합니다.
여기서, 우리는 세포 용해 및 살아있는 세포에서 FCS를 사용하여 집계 된 형태 단백질과 관련된 근위축성 측면 경화증의 확산을 측정하는 절차를 소개합니다. 100밀리미터 플라스틱 접시를 준비하여 일반 성장 매체에 편안하게 앉아 있는 Neuro2a 세포를 성장시다. 세포 소모성을 확인합니다.
매체를 제거합니다. 트립신-EDTA 용액 3.5밀리리터를 세 번째 카트리지 접시에 넣고 섭씨 37도에서 1분간 배양합니다. 9.5 밀리리터 일반 성장 매체를 접시에 넣고 중단합니다.
세포 현탁액은 죽은 세포를 얼룩지게하기 위해 트라이판 블루와 혼합됩니다. 셀 카운팅 슬라이드에 서스펜션을 추가합니다. 셀 카운터를 사용 하거나 수동으로 셀 수를 계산합니다.
라이브 셀 번호와 생존 가능성을 확인합니다. 계산된 배지의 셀을 밀리리터당 5의 힘으로 1.0배 10배 의 힘으로 희석합니다. 셀 리시스 또는 성장 공간 접시를 위해 35mm 플라스틱 접시에 셀 서스펜션 2밀리리터를 추가하여 라이브 셀 측정을 위해 사용할 수 있습니다.
하루 동안 섭씨 37도에서 요리를 배양하십시오. 다음 날, 플라스미드 DNA와 경질 시약의 혼합물을 준비한다. 세포 계산 된 매체에 회입 혼합물을 추가하고 24 시간 동안 세포를 배양합니다.
하루 후. 일상적인 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하십시오. 당신은 세포에서 매우 밝은 TDP25 성분 몸을 볼 수 있습니다.
세포 용해는 생화학적 벤치에서 수행되어야한다. 접시에 매체를 제거합니다. 25도에 PBS 2밀리리터를 추가하여 중간 크기로 세척합니다.
PBS를 제거합니다. 분쇄된 얼음 위에 알루미늄 접시에 접시를 놓습니다. 즉시 200 마이크로리터 리시스 버퍼를 접시에 넣습니다.
셀 스크레이퍼를 사용하여 접시를 긁어냅니다. 새로운 1.5 밀리미터 튜브에서 용해되지 않은 세포 파편으로 용해된 용해를 복구합니다. 섭씨 4도에서 리자테를 원심분리합니다.
라이브 셀 측정의 경우 측정 전에 배지를 새 것으로 교체하십시오. 위상 대비 현미경을 사용하여 세포 부착물을 확인하십시오. 또한 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하십시오.
공초점 현미경 결합 FCS 시스템을 사용합니다. 488 나노미터 레이저를 켭니다. 적어도 30분 동안 시스템을 안정화합니다.
광학 경로를 설정합니다. 인스턴트 라이트에 488 나노미터 레이저를 사용합니다. 적절한 빔 스플리터와 이색계를 사용합니다.
그리고 또한, 형광 fusers. 일반적으로 교정 및 솔루션 측정을 위해 커버글래스 챔버를 사용합니다. 조심스럽게, 커버 글래스 챔버를 가져 가라.
렌즈 스크리닝 용지에 유리 표면을 놓습니다. FCS 교정을 붓습니다. 로다민 6G 용액도 추가합니다.
목표에 초순수물을 추가합니다. 오일을 사용하지 마십시오. 현미경 단계에 챔버를 설정합니다.
스테이지를 적절한 위치로 이동합니다. 핀홀 조정을 만들고 핀홀 조정 마법사를 엽니다. 광자 카운트 속도를 x 방향에 대한 핀홀의 거친 움직임으로 모니터링합니다.
가장 밝은 위치는 정당하게 결정되었다. 다음으로, 광자 카운트 속도를 미세한 움직임으로 모니터링합니다. 가장 밝은 위치는 X 방향의 핀홀 위치입니다.
같은 방법으로, y 방향에 대한 핀홀의 밝은 위치를 검색합니다. y 방향에 대한 가장 밝은 위치도 성공적으로 결정되었습니다. 핀홀의 x 및 y 위치를 화합물로 처리합니다.
매일 측정하기 전에 핀홀 위치를 조정하는 것이 좋습니다. 라이브 경로가 변경되면 핀홀 위치를 다시 조정해야 합니다. 카운트 속도를 만들고 전화 개수 속도를 모니터링합니다.
CPM 모니터링 모드로 변경합니다. CPM 값이 가장 높은 개체의 보정 링을 계산합니다. 카운트 속도 창을 닫습니다.
로다민 6G 용액 측정부터 시작합니다. 측정이 완료되면 피팅을 클릭하여 곡선 피팅 분석을 수행합니다. 이전 상관 관계 함수의 피팅을 위한 모델을 선택합니다.
로다민 6G의 경우, 삼중 상태로 1성분, 3차원 확산을 위한 모델을 선택한다. 빨간색 선을 이동하여 피팅 시작 시간을 설정합니다. 피팅 계산을 시작하려면 모두 맞춤을 클릭합니다.
적합 편차를 확인합니다. 면이 게시되고 음수, 약 0이 있는지 확인하십시오. 장착된 값을 확인합니다.
확산 시간이 대략 20-30 마이크로초 범위인지 확인하십시오. 또한, 구조적 파라미터는 4~8. 핏 패널을 열고 측정을 위한 모델을 선택합니다.
맞춤 패널의 샘플에 대한 모델에서 동일한 구조 파라미터 값을 입력합니다. 형식을 고정된 것으로 설정해야 하는지 확인합니다. 세포 용해에서 GFP-TDP25 측정.
덮개 유리 챔버에 lysate를 놓습니다. 덮개가 마르지 않도록 뚜껑을 놓습니다. 조명 차광을 위해 스테이지 뚜껑을 놓습니다.
인수 패널에서 레이저 전력, 측정 시간 및 반복을 설정합니다. 인수를 시작합니다. 스파이크가 관찰되었습니다.
스파이크가 다시 관찰되었습니다. 스파이크는 검출 바디를 통과한 밝은 분자를 나타냅니다. 스파이크는 수용성 올리고머 또는 골재를 나타냅니다.
곡선 피팅 분석을 수행하기 위해 적합을 만듭니다. 삼중 상태로 2성분, 3차원 확산을 위한 모델을 선택합니다. 피팅 시작 시간을 설정합니다.
모든 맞춤을 클릭합니다. 장착된 값을 확인합니다. SOD1-G85R은 라이브 셀에서 GFP 측정으로 태그됩니다.
용액 측정과는 달리, 열 단계 인큐베이터를 사용하는 것이 좋습니다. 현미경 단계에서 세포 배양 접시를 설정합니다. 안구를 사용하여 초점과 위치를 확인합니다.
측정 셀을 선택합니다. 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 셀 위치를 확대 및 조정합니다. 느린 스캐닝 속도 모드를 사용하여 셀의 스냅샷을 획득합니다.
위치 도구를 사용하여 FCS 측정 위치를 선택합니다. 십자선은 측정 위치를 나타냅니다. 측정을 시작합니다.
광자 수율 기록의 약간의 감소는 GFP의 광표백을 시사합니다. 커브 피팅을 수행합니다. 세포 용해에서 GFP-TDP25의 대표적인 결과가 나타난다.
상단 그래프는 광자 수비율의 레코드입니다. 화살표가있는 경우 가시화, 수용 성 올리고머와 집계를 제안스파이크입니다. 중간 그래프는 이전 상관 관계 함수를 나타냅니다.
회색 선은 낮고 오래된 상관 관계 함수를 표시합니다. 마젠타 라인은 장착 된 기능을 보여줍니다. 점선은 피팅의 시작 시간과 종료 시간을 나타냅니다.
아래쪽 표에는 장착된 값이 표시됩니다. 다음으로, 라이브 셀에서 SOD1-G85R-GFP의 대표적인 결과가 나타난다. 상단 그래프는 광자 수비율의 레코드를 나타냅니다.
기록된 광자 수비율의 점진적인 감소가 관찰되었으며, 다양한 측정에 대한 GFP 성장의 광표백을 시사합니다. 이것은 살아있는 세포에 있는 느린 확산 속도 때문입니다. 중간 그래프는 SOD1의 이전 상관 관계를 나타냅니다.
회색 선은 낮고 오래된 상관 관계 함수를 표시합니다. 마젠타 라인은 장착 된 기능을 보여줍니다. 점선은 피팅으로 시작 시간과 종료 시간을 나타냅니다.
아래쪽 표에는 장착된 값이 표시됩니다. 여기서 우리는 당신에게 세포 용해에서 TDP-25와 관련된 모든 세포에서 확산을 측정하고 FCS를 사용하여 라이브 세포에서 SOD1의 모든 돌연변이를 측정하는이 절차를 보여줍니다. 세포 용해의 수용성 올리고머 및 응집은 종종 스파이크 또는 버스트로 관찰 될 수 있습니다.
다른 한편으로는, 살아있는 세포에서, 그 같은 스파이크는 드물게 관찰되지 않습니다, 가능성이 명백한 살아있는 구조를 제외하고. 돌연변이 SOD1의 천천히 확산 종은 우리를 위해 내부에 SOD1 균합합합합화와 같은 단일 입자에 대한 평균 밝기를 추가합니다. 여기에 표시된 절차는 간단하고 가치가있습니다.
FCS에는 방사선이 없습니다. 그것은 단지 당신의, 그리고 우리의, 상상력 공감입니다.
